Sammendrag

Der er foretaget en undersøgelse af forskellige antibiotikas effekt på kimtallet i fortyndet ornesæd med henblik på at finde det mest velegnede til at hæmme bakterievæksten i den fortyndede sæd under opbevaring.

Undersøgelsen har vist, at neomycinsulfat, evt. sammen med penicillin, må anses for det mest velegnede, samt at en resistensbestemmelse alene ikke kan erstatte kimtalsbestemmelse, når det gælder valg af antibiotikum.

Indledning

Sæd opsamlet i kunstig skede er ikke bakteriefri. En vis mikrobiel forurening vil altid finde sted, hovedsagelig fra præputium, penis og højereliggende dele af genitalkanalen. Den væsentligste del af denne mikrobielle forurening er saprofytære arter af Micrococcus, Corynebacterium, Bacillus, Streptococcus, Proteus, E. coli, Klebsiella, Pseudomonas og andre gram-negative stave, foruden gær og skimmelsvampe. Størstedelen af floraen udgøres af de gram-negative bakterier. Alle disse bakterier er i stand til at formere sig i den fortyndede sæd, hvis opbevaringstemperatur ligger mellem 18-21 ºC. For at forhindre for kraftig bakterievæskt under opbevaring tilsættes derfor antibiotika. I begyndelsen anvendtes penicillin og streptomycin, men siden 1981 har neomycinsulfat været det foretrukne antibiotikum.

Inden for de sidste par år har udenlandske undersøgelser angivet, at andre antibiotika har større baktericid effekt på bakteriefloraen i ornesæd end neomycinsulfat, bl.a. gentamycin og spectinomycin, som hører til aminoglykosidgruppen, og lincomycin.

Gentamycin er virksom overfor enkelte gram-positive bakterier af slægten Micrococcus og Streptococcus og praktisk taget alle gram-negative bakterier. Spectinomycin er især virksom overfor gram-negative bakterier, og lincomycin især overfor gram-negative bakterier samt visse patogene mykoplasmer.

For at få belyst om disse antibiotika har en større hæmmende effekt på bakterievæksten i fortyndet ornesæd end penicillin, streptomycin og neomycin er gennemført en undersøgelse af kimtallet i ornesæd efter fortynding med fortyndingsvæske indeholdende ovennævnte antibiotika. Forsøgt blev udført på Forsøgsornestationen Hatting I.

Materiale og metode

Umiddelbart efter sædopsamling og filtrering fortyndedes sæden med EDTA-fortynder indeholdende antibiotika som nedenfor angivet. Fortyndingsgrad 1:2 (1 + 1). Prøverne blev opbevaret i tre døgn ved 21 ºC, som er den højeste grænse for alm. opbevaringstemperatur for ornesæd. Herefter blev der foretaget kimtalsbestemmelse efter udsæd på Plate Count Agar (D.S. nr. 2251) og inkubering i tre døgn ved 21 ºC. Laveste fortyndingsgrad: 1.000 x el. 1 x. På råsæden blev ligeledes foretaget kimtalsbestemmelse, men udsæden blev foretaget på sædopsamlingsdagen. Laveste fortynding: 1 x. Der blev desuden foretaget resistensbestemmelse for 2-4 rendyrkede, dominerende bakterietyper pr. ejakulat. Resistensbestemmelse direkte på råsæden var ikke mulig, da der ofte fremkom uklarhed/kolonidannelse i opklaringszonen som følge af vækst af resistente bakterier i blandingsfloraen.

Fortyndingsvæsken var tilsat følgende mængder antibiotika/ml: 1 mg neomycinsulfat (NM), 1.000 i.e. benzylpenicillin (P), 1 mg dihydrostreptomycin (S), 20 µg gentamycin (G), 500 i.e. benzylpenicillin + 0,5 mg dihydrostreptomycin (P+S), 1.000 i.e. benzylpenicillin + 20 µg gentamycin (P+G), 0,5 mg neomycinsulfat + 5O0 i.e. benzylpenicillin (NM+P), 1 mg neomycinsulfat + 1 mg lincomycin (NM+L), 0,5 mg lincomycin + 1 mg spectinomycin (L+SP) og kontrol: ingen antibiotika (K).

Resultater

Tabel 1. Resultater fra resistensbestemmelser
	Penicillin					Streptomycin
	Bakteriekoloni nr.					Bakteriekoloni nr.
Orne	1	2	3	4	1		2	3	4
2676	R	R			MF		MF
2891	R	F	R		MF		MF	MF
4106	R	R	F	R	MF		F	MF	F
5393	R	O			R		O
5221	R	R	R	F	MF		MF	F	F
2945	R	MF			R		R
132	R	F	R	R	F		F	F	MF
Bl. sæd 15 orner	R	O	O		R		R	R
Bl. sæd 12 orner	R	R	R		MF		MF	MF
		R	MF	F			R	MF	F
Antal kolonier		19	1	4			6	13	7
pct.		79	4	17			23	50	27

Tabel 1. Resultater fra resistensbestemmelser - fortsat
	Neomycin					Gentamycin
	Bakteriekoloni nr.					Bakteriekoloni nr.
Orne	1	2	3	4	1		2	3	4
2676	MF	F			F		F
2891	MF	F	MF		F		F	F
4106	F	F	MF		F		MF	F
5393	R	O			F		O
5221	F	MF	F	F	F		F	F	F
2945	R	MF			F		F		F
132	F	F	F	MF	R		F	F
Bl. sæd 15 orner	R	R	R		MF		MF	MF
Bl. sæd 12 orner	MF	R	MF		MF		F	F
		R	MF	F			R	MF	F
Antal kolonier		6	9	10			1	5	19
pct.		24	36	40			4	20	76

I tabel 1 er vist resultaterne af resistensbestemmelserne fra syv enkelte ejakulater og fra to blandede sædprøver indeholdende sæd fra henholdsvis femten og tolv orner. Det ses af tabellen, at kun én ud af 25 bakteriekolonier var resistent overfor gentamycin, og nitten ud af 24 var resistente overfor penicillin. Nitten ud af de 25 bakteriekolonier viste sig fuldt følsomme overfor gentamycin, hvorimod kun ti, syv og fire viste fuld følsomhed overfor henholdsvis neomycin, streptomycin og penicillin.

I tabel 2 er vist resultaterne af kimtalsbestemmelserne på råsæd og fortyndet sæd, indeholdende forskellige antibiotika som angivet i teksten. Det fremgår af tabellen, at selv med relativt lave kimtal i råsæden på opsamlingstidspunktet, vil fortyndet sæd uden tilsætning af antibiotika efter tre dages opbevaring indeholde mange millioner bakterier.

Tilsætning af antibiotika har som forventet hæmmet bakterievæksten i den fortyndede sæd. Dårligst effekt er opået ved tilsætning af lincomycin + spectinomycin og neomycin + lincomycin. Tilsætning af de øvrige undersøgte antibiotika, gentamycin, penicillin, streptomycin og neomycin, alene eller i kombination, har resulteret i kimtal, som i 37 ud af 44 prøver, svarende til 84 pct. har været < 1.000 eller endog lavere. Fem prøver havde et kimtal på <= 15.000 og i to prøver fandtes kimtal på henholdsvis 81.000 (NM) og 1,6 mio. (G).

Tabel 2. Resultater af kimtalsbestemmelse i råsæd og fortyndet sæd. Antal kim/ml
			Antibiotika i fortyndingsvæsken
Orne	Råsæd	Kontrol	L + SP	NM + L	NM
A	24.00	6 mio.	1,2 mio.	270.000	15.000
B	300	4 mio.	400.000	56.000	6.100
C	11.000	13 mio.	950.000	2,8 mio.	11.000
D	2.800	3 mio.	270.000	21.000	13.000
E	4.100	3 mio.	1,0 mio.	38.000	<1.000
2676	13.000	850.000			<1.000
2891	19.000	83 mio.			4.000
5393	43.000	27 mio.			<100
5221	8.800	20 mio.			<1
2945	5.800	17 mio.			<100
132	36.000	26 mio.			<100
Bl. sæd 15 orner	65.000	86 mio.			81.000
Bl. sæd 12 orner	24.000	55 mio.

Tabel 2. Resultater af kimtalsbestemmelse i råsæd og fortyndet sæd. Antal kim/ml - fortsat
	Antibiotika i fortyndingsvæsken
Orne	NM + P	G	P	S	P + S	P + G	Lavest fort. ved udsæd
A							-3
B							-3
C							-3
D							-3
E							-3
2676		<1.000				<1.000	-3
2891		1,6 mio.				<1.000	1
5393	<100	<100	<100	<100	<1		1
5221	<1	<1	<1	<1	<1		1
2945	<1	<1	<1	<100	<1		1
132	<100	<1	<1	<1	<1		1
Bl. sæd 15 orner	<1.000		<1.000		<1.000	<1.000	-3
Bl. sæd 12 orner	<1.000		<1.000	<1.000	<1.000		-3

Diskussion og konklusion

Bakteriefloraen i ornesæd består normalt af en række saprofytære bakterier, hvis stofskifteprodukter påvirker det medium, hvori sæden er fortyndet, således at sædcellernes overlevelsesevne nedsættes. Ved tilsætning af antibiotika forsøger man at hæmme en for kraftig bakterievækst under sædens opbevaring.

I herværende undersøgelse er effekten af en række nye og gamle antibiotika blevet afprøvet for deres virkning på kimtallet i fortyndet ornesæd.

Resultatet af kimtalsbestemmelserne viser, at lincomycin + spectinomycin og neomycin + lincomycin ikke har kunnet hæmme bakterievæksten i den fortyndede sæd i tilnærmelsesvis samme omfang som de øvrige undersøgte antibiotika, neomycin, penicillin, gentamycin og streptomycin, alene eller i kombination, og at effekten af alle disse stoffer stort set har været den samme.

Der er uoverensstemmelse mellem resultaterne af resistensbestemmelserne og kimtalsbestemmelserne. På grundlag af resistensbestemmelserne skulle man forvente, at gentamycin havde en større effekt på kimtallet i den fortyndede sæd end de øvrige antibiotika. Dette har ikke været tilfældet.

Årsagen hertil kan være, at når alle de gram-negative, gentamycinfølsomme bakterier hæmmes, får gentamycinresistente, gram-positive bakterier bedre vækstmuligheder. Dette kan bl.a. forklare det meget høje kimtal i en af de gentamycinholdige prøver.

Det er endvidere bemærkelsesværdigt, at penicillin alene, med resistensbestemmelserne i mente, har kunnet udøve en så stærk hæmmende virkning på bakterievæksten i den fortyndede sæd. Her må det som tidligere nævnt erindres, at resistensbestemmelserne kun er foretaget på de 2-4 dominerende bakterietyper, og ikke på blandingsfloraen.

Penicillin hæmmer især gram-positive bakterier, mens de fleste gram-negative, som jo er dominerende, er penicillinresistente. Resistensbestemmelserne vil derfor vise penicillinresistens. Endvidere har de dominerende gram-negative typer i råsæden (Eschericia soli, Proteus, Klebsiella) temperaturoptimum ved 37 ºC. De vil derfor have længere nølefase ved den anvendte opbevarings- og dyrkningstemperatur, 21 ºC, hvor psykrotrofe typer som Pseudomonas, Acinetobacter og visse Bacillusarter favoriseres. Formentlig er nogle af de psykrotrofe bakterier, især de gram-positive, penicillinfølsomme. Endelig kan en interaktion mellem de tilstedeværende bakterier i bakteriefloraen i sig selv udøve en væksthæmmende virkning. Disse forhold kan være forklaringen på de lave kimtal i de penicillinholdige prøver.

Sammenholdes resultaterne af begge undersøgelser, resistensbestemmelse og kimtalsbestemmelse, må gentamycin anses for det mest effektive af de undersøgte antibiotika til hæmning af bakterievæksten i fortyndet ornesæd.

Gentamycin hører til de stærke antibiotika, som bør forbeholdes alvorlige infektioner, hvor andre antibiotika/kemoterapeutika har vist sig virkningsløse. Da resultaterne af kimtalsbestemmelserne viser, at gentamycin ikke har større effekt end neomycin, penicillin og streptomycin, bør man derfor foretrække disse antibiotika fremfor gentamycin, og ikke anvende dette antibiotikum profylaktisk i fortyndingsvæsker med risiko for at skabe unødvendige resistenser.

Tidligere undersøgelser (Meddelelse fra Statens Husdyrbrugsforsøg, 1981 nr. 392) har vist, at neomycin bør foretrækkes fremfor penicillin + streptomycin på grund af neomycins bedre holdbarhed i opløsning.

På grundlag af ovennævnte og herværende undersøgelse må neomycin, evt. i kombination med penicillin, fortsat anses for det mest velegnede af de undersøgte antibiotika til fortyndingsvæsker for ornesæd.

Skal de to in vitro metoder, kimtalsbestemmelse og resistensbestemmelse, vurderes hver for sig med henblik på at finde egnede antibiotika til ornesæd, må kimtalsbestemmelsen anses for den mest velegnede.

Undersøgelse af forskellige antibiotikas effekt på kimtallet i fortyndet ornesæd