En undersøgelse af instrument til måling af sædcellers bevægelighed har resulteret i en standardiseret analyseprotokol. Sikkerheden for en måling med denne protokol er cirka ± 6,3 procentenheder ved vurdering af andelen af progressive bevægelige sædceller

Undersøgelse af sæd fra KS-stationer har altid omfattet undersøgelse af sædcellernes bevægelighed. Traditionelt set har undersøgelsen været en subjektiv vurdering udført manuelt med mikroskop. Med nyere metoder er man i dag i stand til at få en computer til at måle sædcellernes bevægelighed. I dag kan et sådant instrument undersøge 15 forskellige områder i mikroskop og samlet analyseres 1000 - 1400 celler pr. sædundersøgelse.

Formålet var at undersøge CASA instrumentet SpermVision, således at der kunne udfærdiges en procedurebeskrivelse for vurdering af sædcellernes bevægelighed. Samtidig skulle metodens repeterbarhed vurderes.

Analysens afhænger af, at råsæden har været tilstrækkeligt filtreret for gelatinøse partikler, da disse kan have stor betydning for måleresultatet. Gelatinøse partikler i sæden vil dog altid være årsag til, at bevægeligheden af sæden vurderes lavere og aldrig resulterer i en overestimering af sædcellernes bevægelse.

Ved måling med SpermVision CASA System kan sæden reaktiveres i 20-50 minutter. Det vil give en fordel at reaktivere sæden i 50 minutter, idet betydningen af, om analysen gennemføres inden for ± 5 minutter, formentlig bliver forholdsvis mindre end hvis reaktiveringen var 20 minutter. Reaktiveringstiden betyder ikke noget for estimeringen af andelen af bevægelige sædceller, men kan påvirke sædcellerne til at have en gennemsnitlig lavere bevægelseshastighed ved øget reaktiveringstid.

SpermVision CASA System har høj repeterbarhed ved gentagne målinger af samme sædprøve (repeterbarhed på 6,2) og analyse af sæddoser fra samme ejakulat. Samtidig er der relativt store forskelle mellem forskellige orner, og forholdsvis lille forskel mellem forskellige ejakulater fra samme orne. Det kan derfor konkluderes, at instrumentet vil være velegnet til løbende overvågning af sædens holdbarhed for orner på KS-stationer (vejledning til analysen er vedlagt som appendiks 4).

Baggrund

Kvalitetsvurdering af sæd har traditionelt altid omfattet vurdering af sædcellers bevægelighed. Denne vurdering gennemføres med mikroskop og er en subjektiv vurdering. En subjektiv vurdering giver meget store forskelle mellem forskellige personer [1]. Specielt var det vanskeligt at vurdere sæd, når sædens bevægelighed ikke var optimal. Det har derfor været forsøgt siden 1980’erne at udvikle instrumenter, der automatisk kan måle sædcellernes bevægelighed. Dette lader sig nu gøre ved at koble et kamera til et mikroskop, digitalisere en film af sædceller i bevægelse og lade computeren følge hver enkelt sædcelles bevægelse - Computer Assisted Sperm Analysis eller CASA. De første instrumenter kunne analysere en enkelt film optaget på en enkelt position (et felt). Dette giver en analyse af cirka 80-100 sædceller, hvilket ikke giver tilfredsstillende repeterbarhed, men stadig meget bedre end en subjektiv vurdering. I dag kan der undersøges 15 forskellige felter og samlet analyseres 1000 - 1400 celler pr. sædundersøgelse med CASA.

På trods af denne udvikling mangler der stadig en beskrivelse af, hvordan sædens bevægelighed analyseres og beskrives helt korrekt. I 1990’erne blev det forsøgt at lave en generel beskrivelse af, hvordan sædcellers bevægelighed vurderes [2], men der er til dato ikke præsenteret en standardiseret analyse af ornesæd med CASA. Årsagen til dette skyldes formentlig, at meget få studier har vist sammenhæng mellem frugtbarhed og sædcellernes bevægelighed. I 1997 blev der fundet sammenhæng mellem kuldstørrelse og sædens bevægelighed målt dagen efter produktion af sæddoser [3]. Dog blev repeterbarheden for metoden ikke beskrevet. Repeterbarheden for måling med CASA er angivet til at være cirka 2,4 - 3,1 pct. [4]. Det betyder, at resultatet i 95 procent af analyserne kan gentages til at være ± 4,8 - 6,2 procent i forhold til procent bevægelige sædceller. Producenten af CASA instrumentet har imidlertid ikke angivet forventet repeterbarhed for instrumentet.

Formålet med afprøvningen var at udfærdige en procedurebeskrivelse for analyse af sædens bevægelighed med CASA instrumentet SpermVision fra firmaet Minitüb i Tyskland, således at repeterbarheden og nøjagtigheden for en analyse var højest mulig. Procedurebeskrivelsen blev sammensat efter detaljeret viden om styrker og svagheder ved instrumentet. Disse styrker og svagheder skulle beskrives gennem flere mindre undersøgelser. De mindre undersøgelser omfattede betydning af gelatinøse partikler i sæden, undersøgelse af korrekt varmereaktiveringstid inden analysen samt undersøgelse af variation mellem dobbeltbestemmelser af sæddoser og beregning af forskelle mellem orner.

Materiale og metode

Undersøgelse 1 – betydning af gelatinøse partikler i sæden

Formålet var at estimere betydningen af gelatinøse partikler i sæd. Der blev udtaget en sædopsamling fra 20 forskellige KS-orner, hvoraf 10 sædopsamlinger havde mange gelatinøse partikler i sæden og 10 havde få, vurderet subjektivt ud fra mikroskopisk undersøgelse af sæden. Sæd fra hver sædopsamling blev analyseret med SpermVision (motility video package 1428) umiddelbart efter sædopsamling samt på 3. dagen efter opsamlingen. I hver analyse blev videooptaget syv felter i tællekammeret Leja-4 (20µm) til analyse. I hver videosekvens klassificerede instrumentet et antal partikler som værende sædceller. For hvert felt blev der manuelt optalt, hvor mange partikler der var identificeret forkert - både sædceller der var overset og partikler, identificeret som sædceller, der reelt ikke var sædceller. Se appendiks 1 for detaljeret beskrivelse af analysemetoden med SpermVision i denne undersøgelse.

Statistisk analyse
Antallet af partikler der blev overset eller klassificeret forkert, blev analyseret med proc mixed i SAS. Ornen og tidspunkt for analyse af sæden indgik som tilfældig effekt.

Undersøgelse 2 – varme reaktiveringstid for sæden inden analyse

Formålet var at afklare, om der var forskelle i analysen ved varmereaktiveringstider på 20, 30, 40 eller 50 minutter. Undersøgelse 2 omfattede en sædopsamling fra 24 forskellige orner opsamlet tilsammen på 8 forskellige dage. Hver sædopsamling blev godkendt i henhold til daværende gældende regler for KS-stationerne [5]. Fra hver sædopsamling blev udvalgt to forskellige sæddoser til analyse med SpermVision. Den ene sæddose blev analyseret efter tre timers opbevaring ved 16-18 grader celsius, mens den anden dose blev analyseret på tredje dagen efter sædopsamling og blev opbevaret ved 16-18 grader celsius indtil analyse.

Ved analysen blev sæden blandet grundigt inden cirka 10 ml blev overført til fire forskellige NUNC-rør. NUNC-rørene blev efterfølgende varmereaktiveret i enten 20, 30, 40 eller 50 minutter i 38 grader varmt vandbad. Hver analyse omfattede målinger af sædcellernes bevægelighed 15 forskellige steder i et tællekammer (se appendiks 2 for detaljeret beskrivelse).

Statistisk analyse
Andelen af progressive bevægelige sædceller er analyseret med SAS version 9.1.3. Analysen er gennemført med Proc mixed. I modellen indgik prøven (ejakulatet) samt sædens alder ved analysen som tilfældig effekt og det blev antaget at estimatet for hvert af felterne i analysen var uafhængige af hinanden.

Undersøgelse 3 - Analysens repeterbarhed og ornevariationen

Undersøgelsen omfattede sæd fra 80 forskellige orner, fordelt med 8 Landrace, 12 Yorkshire og 60 Duroc-orner. Ornerne blev sædopsamlet to gange til undersøgelsen, hvoraf der fra 72 af ornerne indgik yderligere en sædopsamling. Alle sædopsamlinger blev gennemført i henhold til regler for KS-stationerne [5]. Sæden blev opsamlet med mindst 14 dages mellemrum mellem hver af sædopsamlingerne fra samme orne i undersøgelsen. Ornerne blev i denne periode sædopsamlet cirka 1-2 gang ugentligt.

Fra hver sædopsamling blev udvalgt to sæddoser, som straks efter produktionen blev lagret ved 16-18 grader celsius. På tredje dagen efter produktion blev sæden analyseret med SpermVision.

Analysen med SpermVision omfattede dobbeltbestemmelse af sædens bevægelighed for begge sæddoser - i alt fire målinger pr. ejakulat. På tredje dagen efter sædopsamlingen blev fra hver sæddose blev overført cirka 10 ml sæd til to forskellige NUNC-rør. Sæden i NUNC-rørene blev varme reaktiveret i 50 minutter i 38 grader varmt vandbad. Efter reaktivering blev sæden i NUNC-røret blandet grundigt inden 2,3 µl sæd, med pipette, blev overført til et 20 µm dybt Leja-4 tællekammer. Pipettespidsen blev holdt i cirka 45 grader vinkel i forhold til leja-kammeret ved fyldning af kammeret. Hvis partikler, der ikke var sædceller, bevægede sig med væskestrømme i kammeret, blev analysen kasseret og et nyt tællekammer blev fyldt. Analysen med SpermVision blev udført hurtigst muligt efter fyldning af kammeret (se appendiks 3 for detaljer for analysen med SpermVision). Resultaterne omfattede måling af sædcellernes bevægelsesmønster, som danner grundlag for beregning af hvorvidt sædcellen var bevægelig (appendiks 3). Analysen i SpermVision bestod i måling af andelen af bevægelige sædceller fem forskellige steder i tællekammeret, hvor samlet resultat for en analyse af en sædprøve bestod i gennemsnittet for fem forskellige målinger i samme tællekammer.

Statistisk analyse
Variationen i målingen af andelen af bevægelige sædceller mellem de fem forskellige områder i tællekammeret blev analyseret med variansanalyse. Det blev antaget, at felterne var uafhængige af hinanden. Som tilfældig effekt indgik ornen, ejakulatet, dose (der var to doser fra samme ejakulat) samt om det var 1. eller 2. bestemmelse af sædens bevægelighed. Som fikseret effekt indgik ornens race.

Analysens repeterbarhed (variationen mellem dobbeltbestemmelser), forskelle mellem doser fra samme ejakulat samt forskelle mellem orner blev analyseret med proc mixed i SAS. Den afhængige variabel var beregnet som gennemsnit af de fem felter i hver analyse. Som tilfældig effekt indgik ornen, ejakulatet samt dose (der var to doser fra samme ejakulat).

Undersøgelse 4 - repeterbarhed for metoden efter periode med stabil drift

Undersøgelsen omfattede dobbeltbestemmelse af tre dage gammel sæd fra 164 forskellige sædopsamlinger fra Duroc-orner. Sæden blev opsamlet i en periode fra 5. marts 2008 til 1. juli 2008. Analyserne blev foretaget i henhold til protokollen beskrevet i appendiks 4.

Statistisk analyse
Andelen af progressive bevægelige sædceller blev bestemt i henhold til analysemetoden beskrevet i appendiks 4. Repeterbarheden for bestemmelsen af andelen af progressive bevægelige sædceller blev analyseret med proc mixed i SAS. Som tilfældig effekt indgik sædopsamlingen.

Repeterbarheden blev beregnet som 1,96 × kvadratroden af variationen for dobbeltbestemmelserne.

Resultater og diskussion

Resultaterne fra undersøgelse 1 viste ikke entydigt, at gelatinøse partikler kan påvirke målingen af sædcellernes bevægelighed målt som % bevægelige sædceller. Resultaterne indikerede, at gelatinøse partikler i enkelte sædopsamlinger påvirkede identifikationen af partikler, mens andre ikke blev påvirket. Der var overraskende mange oversete sædceller på tredje dagen (tabel 1), hvilket kan skyldes sammenklumpning af sædcellerne. Instrumentet kan ikke identificere to sædceller der ligger helt tæt. Denne type fejl kan være overestimeret, da denne undersøgelse kun omfattede 10 sædopsamlinger, hvorfor få sædopsamlinger med dette problem kan påvirke resultatet forholdsvis meget.

Tabel 1.

Resultater for effekten af gelatinøse partikler. Gennemsnit for antal partikler der blev identificeret forkert.

Gelatinøse partikler	Tid efter sædopsamling	Identifikation af sædceller i analysen
		Oversete sædceller (gennemsnitligt antal)	Var ikke sædceller (gennemsnitligt antal)	Antal partikler fundet af instrumentet
Mange	Samme dag som sædopsamling	3,6 ^a	5,9 ^a,b	70
	3 dage efter sædopsamling	8,1 ^b	6,5 ^a	74
Få	Samme dag som sædopsamling	3,3 ^a	4,8 ^a	67
	3 dage efter sædopsamling	9,4 ^b	3,0 ^b	65
a, b: Forskellige bogstaver indikerer statistisk sikker forskel inden for samme kolonne (p<0,05)

Betydningen af fejl i klassificeringen vil være størst, hvis partikler i sæden fejlagtigt bliver genkendt som sædceller. Disse partikler kan ikke have bevægelighed, hvorfor sædens bevægelighed vil blive vurderet for lavt. Hvis sædceller bliver overset af instrumentet, og det ikke hænger sammen med, om sædcellen var bevægelig, ville de kun have indflydelse, hvis man skulle anvende instrumentet til koncentrationsbestemmelse. Betydningen vil også afhænge af, hvor mange sædceller et felt indeholder, da mængden af sædceller i et felt ikke har betydning for om instrumentet identificerer andre partikler som sædceller.

Undersøgelsen af varmereaktiveringstider på 20, 30, 40 og 50 minutter viste ingen forskelle mellem grupperne hverken ved analyse samme dag som produktion af sæddoserne eller tre dage efter produktion. Derimod var der stor forskel mellem de 15 forskellige områder, der blev analyseret i hvert tællekammer (figur 1).

InfoSvin/p3%5Ffig1%5Fvenstre%20side1338.tif

InfoSvin/p3%20figur%201%5Fh:C3B8jre%20side1339.tif

Figur 1.
Grafisk fremstilling af andelen af progressive bevægelige sædceller for hvert af de 15 felter i analysen. Venstre og højre figur angiver resultaterne henholdsvis for analyse foretaget inden for 24 timer efter sædopsamling og på 3. dagen efter sædopsamling. Hver linie angiver forskellig varme reaktiveringstid i minutter af sæden inden selve analysen. Sort=20; blå=30; rød=40; grøn=50. Billede nr. 1338 og 1339

Undersøgelser har vist, at tællekamrene, som blev anvendt i denne undersøgelse, var defekte idet kamrene var årsag til reduktion i sædcellernes bevægelighed. Dette forhold var hovedårsagen til faldet i bevægelighed fra felt 8 til 15. Dette blev dog ikke erkendt pågældende tidspunkt, men først efter hele afprøvningen var afsluttet. Dette bevirkede, at samme batch af tællekamre blev anvendt i næstfølgende undersøgelse - undersøgelse 3. Idet sammenligningen mellem grupperne er foretaget med samme batch af tællekamre og repeterbarheden ikke skulle estimeres, kunne resultaterne for alle felterne godt anvendes. Det kan dog ikke sammenlignes til andre undersøgelser med anden batch af tællekamre.

Konklusionen blev at anvende varme reaktivering i 50 minutter. Med denne forholdsvis lange varme reaktiveringstid forventes en meget mindre effekt på resultatet, hvis prøven analyseres ± 5 minutter i forhold til reaktiveringstiden end hvis der anvendes kortere reaktiveringstider. Resultaterne fra undersøgelse 2 viste et kraftigt fald i sædens bevægelighed gennem analysen. Dette medførte, at der i undersøgelse 3 blev valgt at analysere et andet sted i tællekammeret. Det nye område skulle have mindre variation end området anvendt i undersøgelse 2.

Undersøgelse 3 skulle afdække instrumentets repeterbarhed mellem felterne i analysen og mellem to separate tællekamre samt forskelle mellem orner. Som nævnt ovenfor blev tællekamre der var defekte anvendt i denne undersøgelse. Dette betød, at fem ud af de 15 analyserede felter i hvert tællekammer kunne anvendes til beregning af sædcellernes bevægelighed. Betydningen af dette har formentlig været, at repeterbarheden har været lidt dårligere, end hvad der normalt kan opnås.

Variansen mellem de forskellige felter i analysen var 40. Denne varians afhænger af, hvor mange celler der bliver målt i hvert felt. I betragtning af at der var maksimalt 80-100 celler pr. felt, er dette en forholdsvis lav varians. En analyse af sædens bevægelighed består af gennemsnittet for fem felter målt i et enkelt tællekammer. Repeterbarheden (målt som variansen) for en måling af sædcellernes bevægelighed kan således forventes at være væsentligt bedre, hvis der bliver analyseret flere end fem felter.

Tabel 2.

Resultater for varianskomponenterne orneforskelle, ejakulatvariation, dosevariation og repeterbarhed for undersøgelse 3.

Varianskomponent	Estimat for varians	Standardafvigelse for estimatet
Orneforskelle	115	122,1
Ejakulatvariation	60,5	7,9
Dosevariation	6,8	1,6
Repeterbarhed	18,8	1,2
Beregningen viste, at variationen ikke var forskellig fra 0 – altså der var ikke nogen effekt af race

Resultaterne for undersøgelse 4, hvor nyeste protokol blev afprøvet (appendiks 4), viste, at variansen for repeterbarheden var 10,4. Dette svarer til, at 95 pct. konfidensinterval for en måling af progressive bevægelige sædceller var 6,2 procentenheder. Dette ligger i stil med andre publicerede data på området [4]. Forbedringen af repeterbarheden fra undersøgelse 3 til 4 skyldtes, at der blev anvendt en anden batch af tællekamre, hvorved det var muligt at analyseres flere felter end de fem der indgik i nærværende afprøvning. Endvidere anvendtes en analysemetode, der bedre sikrer mod fejl ved tællekamrene (se appendiks 4 for detaljeret beskrivelse af denne metode). Det medførte, at antallet af analyserede sædceller blev meget større og repeterbarheden således tilsvarende bedre.

Resultaterne for orneforskelle samt ejakulatforskelle i nærværende afprøvning indikerede, at forskellene mellem ornerne var langt større end forskellene mellem sædopsamlinger fra samme orne. Det kan dog ikke vides om ejakulatvariationen skyldes en ændring hos pågældende orne som ville kunne genfindes i næste ejakulat, eller om effekten skyldes håndteringen af sædopsamlingen pågældende dag. For at afklare dette, skal der analyseres flere ejakulater med fast tidsinterval fra hver orne.

Variationen mellem forskellige sæddoser fra samme sædopsamling var så lav, at der i praksis ikke vil være forskel mellem sæddoser.

De seneste undersøgelser af tællekamrene Leja-4 (ikke publicerede data) har vist, at tællekamre, som er blevet for gamle, påvirker sædcellernes bevægelighed på en systematisk måde. Dette kan der kontrolleres for ved en løbende kvalitetssikring af tællekamrene (fremgangsmåden for denne kvalitetssikring er angivet i appendiks 5).

Konklusion

Analysens kvalitet afhænger af, at råsæden har været tilstrækkelig filtreret for gelatinøse partikler, da disse kan have stor betydning for måleresultatet. Det kan på nuværende tidspunkt kun vurderes subjektivt om sæden indeholder mange eller få gelatinøse partikler. Det vil dog altid være årsag til, at resultatet bliver lavere procent bevægelige sædceller og aldrig resultere i en overestimering af sædcellernes bevægelse.

Ved måling med SpermVision CASA System kan sæden reaktiveres i 20-50 minutter. Det vil give en fordel at reaktivere sæden i 50 minutter, idet betydningen af, om analysen gennemføres inden for ± 5 minutter, formentlig bliver forholdsvis mindre end hvis reaktiveringen var 20 minutter. Reaktiveringstiden betyder ikke noget for estimeringen af andelen af bevægelige sædceller, men kan påvirke sædcellerne til at have en gennemsnitlig lavere bevægelseshastighed ved øget reaktiveringstid.

SpermVision CASA System har høj repeterbarhed ved gentagne målinger af samme sædprøve (repeterbarhed på 6,2) og analyse af sæddoser fra samme ejakulat. Samtidig er der relativt store forskelle mellem forskellige orner, og forholdsvis lille forskel mellem forskellige ejakulater fra samme orne. Det kan derfor konkluderes, at instrumentet vil være velegnet til løbende overvågning af sædens holdbarhed for orner på KS-stationer (vejledning til analysen er vedlagt som appendiks 4).

Referencer

[1]	Vyt, P.; Maes, D.; Rijsselaere, T.; Dejonckheere, E.; Castryck, F.; Van Soom, A.: (2004): Motility assessment of porcine spermatozoa: a comparison of methods. Reproduction in Domestic Animals, 39, pp. 447-453.
[2]	Davis, R.O.; Katz, D.F.: (1993): Operational standards for CASA instruments. Journal of Andrology, 14, pp. 385-394.
[3]	Holt,C.; Holt,W.V.; Moore,H.D.; Reed,H.C.; Curnock,R.M.: (1997): Objectively measured boar sperm motility parameters correlate with the outcomes of on-farm inseminations: results of two fertility trials. Journal of Andrology, 18, 312-323.
[4]	Nicolae, M.: (2006): Untersuchung flüssigkonservierten eberspermas mittels computergestützter spermienanalyse und bindung FITC-konjugierter mannose an die spermienmembran. Doktorafhandling, Tierärztliche Hochschule, Hannover, Tyskland.
[5]	Hansen, C.: (2008): Regler for avl, drift og smittebeskyttelse for KS-stationer. Manual nr. 5, Dansk Svineproduktion.

Afprøvning: 884 samt udvalgte data fra 982.

Appendiks 1

Indstillinger af SpermVision ved undersøgelse 1.

Analysen i undersøgelse et omfattede syv forskellige felter. Felterne var alle placeret i midterplanet på den longitudinelle akse i et tællekammer (figur 2). Inden selve analysen blev billedet justeret til at være i fokus umiddelbart til højre for position 1.


Figur 2.	Skematisk fremstilling af tællekammeret. Tallene i kammeret angiver placeringen af felt 1-7 i analysen. Billede nr. 21335

Appendiks 2

Indstillinger af SpermVision ved undersøgelse 2.

Analysen i undersøgelse to omfattede 15 forskellige felter. Felterne var alle placeret i midterplanet på den longitudinelle akse i et tællekammer (figur 3). Inden selve analysen blev billedet justeret til at være i fokus i positionen mellem felt 14 og 15.


Figur 3.	Skematisk fremstilling af tællekammeret. Tallene i kammeret angiver placeringen af felt 1-15 i analysen. Billede nr. 31336

Bevægelige sædceller var celler der havde AOC (måling af hvor meget sædcellehovedet ændrer orientering) > 5.

Appendiks 3

Indstillinger af SpermVision ved undersøgelse 3.

Analysen i undersøgelse tre omfattede 15 forskellige felter. Placeringen af felterne og placeringen for justering af mikroskopet til at være i fokus var justeret i forhold til undersøgelse 2. Felterne var alle placeret i midterplanet på den longitudinelle akse i et tællekammer (figur 4). Inden selve analysen blev billedet justeret til at være i fokus i positionen angivet med ”X”.


Figur 4.	Skematisk fremstilling af tællekammeret. Tallene i kammeret angiver placeringen af felt 1-15 i analysen samt angivelse af hvor billedet blev justeret til at være i fokus inden analysen. Billede nr. 41337

Bevægelige sædceller var celler der havde AOC (måling af hvor meget sædcellehovedet ændrer orientering) > 5.

Appendiks 4

Vejledning i analyse af sædcellers bevægelighed med SpermVision CASA System

Vejledningen omfatter analyser af sæd, der er fortyndet til sæddoser med en koncentration i nærheden af 30 mio. sædceller pr. ml. Analyserne skal udføres ved anvendelse af Leja-4 tællekamre. Tællekamrene skal være kvalitetskontrolleret senest 1 måned før analysen med pågældende batch af tællekamre (se appendiks 5 for kvalitetskontrol af Leja-4 tællekamre).

Opbevaring af sæddose inden analyse

Sæddosen skal straks efter produktion lagres ved 16-18 grader celsius. Ved lagringen må sæddoserne ikke ligge i lag med mere end to poser oven på hinanden, da dette vil hindre nedkølingen af doserne. Ved forsendelse af doser skal disse transporteres i styrofor-kasse med ekstra væske, således at opvarmning forhindres. Transporten mellem KS-stationer og analyselaboratoriet skal ske så hurtigt som muligt og doserne skal hurtigst muligt efter ankomst til analyselaboratoriet placeres i klimaskab ved 16-18 grader celsius. Doser kan ikke sendes med PostDanmark eller andre transportvirksomheder medmindre forsendelsesmetoden sikrer ensartet temperatur i sæddosen under forsendelsen.

Indstilling af SpermVision inden analyse

Inden igangsætning af analysen skal SpermVision være opstartet og indstillet korrekt. Mikroskopet skal have været tændt mindst 15 minutter inden instrumentet indstilles. Mikroskopet indstilles på følgende måde:

Der ilægges et præparat med sædceller i et Leja-4 tællekammer - og fokus indstilles så sædcellerne står skarpt.
Blænden for lampen lukkes, således at kanterne på blænden kan ses. Højden på condenseren justeres (figur 1) indtil kanterne fra blænden er så skarpe som muligt i billedet på SpermVision (figur 2).

InfoSvin/Billede51334.tif

Figur 1. Angivelse af justeringsværktøjer til mikroskopet. Billede nr. 51334

1 = Centrering af blænden
2 = Justering af faseringe
3 = Højdejustering af kondenser
4 = Blænde

Åbningen i blænden skal være centreret, således at åbningen er placeret præcis i midten af kameraet. Dette gøres ved at justere centreringen af faseringene (figur 2). Blænden åbnes herefter kun lige, således at hjørnerne i billedet ikke er ”formørket” af blænden. (figur 2).


Figur 2. Billede af blænden i mikroskopet ved indstilling af mikroskopet inden analyse med SpermVision. I billedet til venstre ses at blænden er justeret til centrum af billedet. Til højre ses at blænden er åben således at kanerne på blænden ikke kan ses længere. Billede nr. 1331 og 1340

Herefter justeres faseringenes position, således at fasen blokerer mest muligt lys (justering af faseringene - figur 1). Dette måles i SpermVision med ”Light-meeter” funktionen. Begge skruer skal justeres indtil yderligere justering af begge skruer ikke kan blokere mere lys.
Til sidst justeres lysstyrken på mikroskopet til at give korrekt lys-intensitet, som angivet under funktionen Light-meeter i SpermVision. Det er vigtigt, at der er levende sædceller i mikroskopet og billedet er i fokus, når lysintensiteten indstilles (figur 3).
Hvis ikke baggrunden er ensartet mørk skal linser/objektiver på mikroskopet renses.

InfoSvin/append%204%5Ffig%2031332.tif

Figur 3.
Figuren viser anvendelsen af lysmåleren ”light-meeter” i SpermVision. Lysintensiteten skal være justeret til at være mellem 130 og 140 i intensitet. Billede nr. 31332

Reaktivering af sæden

Inden analyse med SpermVision skal sæden reaktiveres. Sæden i en sæddose blandes grundigt (vendes mindst fem gange) inden cirka 10 ml. sæd overføres til et 10 ml NUNC-rør. Det er vigtigt, at der er cirka 1½ cm luft i røret, så sæden kan blandes tilstrækkeligt inden sæd udtages til analysen. Der skal dog ikke være for meget luft, da atmosfærisk luft kan påvirke sædens bevægelighed. Sæden skal blandes inden NUNC-røret placeres i vandbadet men ikke under reaktiveringen.

NUNC-røret placeres i 38 grader varmt vandbad. Analysen med SpermVision skal gennemføres efter 50 ± 5 minutter. Vandstanden i vandbadet skal være maks. 3 cm fra toppen af NUNC-røret. Det er vigtigt, at NUNC-røret aftørres, når det tages op af vandbadet for at forhindre tilblanding af vandet fra vandbadet til prøven.

Analyse med SpermVision CASA system

Inden prøveudtagning skal NUNC-røret vendes 10 gange, hvor luftboblen i røret skal sørge for tilstrækkelig opblanding af sæden. Med FinnPipette udtages cirka 2,4 µl sæd, der fyldes i et 20 µm Leja-4 tællekammer. Efter fyldning af kammeret flyttes prøven straks ind under objektivet i mikroskopet. Prøven skal være placeret under objektivet i 15 sekunder, inden analysen påbegyndes.

Analysen af sædcellernes bevægelighed skal gennemføres med det stage-pattern setup kaldt ”Leja-4 DSP”, som vælges umiddelbart inden analysen påbegyndes.

Beregning af andelen af bevægelige og progressivt bevægelige sædceller

Alle sædceller med AOC > 5 er bevægelige, og bevægelige sædceller med bevægelseshastighed (VSL) > 9 kan klassificeres som progressiv bevægelig.

Appendiks 5

Vejledning i metode til løbende kvalitetskontrol af tællekamre Leja-4 (20µm) til måling af sædcellers bevægelighed

Der skal hver måned mellem den 1. og 7. i måneden gennemføres kvalitetskontrol af Leja-4 tællekamrene. Kontrollen skal tillige gennemføres ved skift til en ny batch af tællekamre. Ved batch forstås både batch nr. angivet af producenten, men det skal også opfattes som ny batch, hvis kamre med samme batch nr. er sendt til forsøgslaboratoriet med to forskellige forsendelser.

En ny batch kan ikke anvendes, før den er godkendt til brug. En allerede tidligere batch kan anvendes indtil der bliver meddelt, at den er defekt. Der skal således ikke ventes på, at resultaterne for en kvalitetskontrol, for en allerede godkendt batch, bliver godkendt.

Når der skiftes batch af Leja-4 kamre SKAL det tydeligt noteres i journal-bogen i forsøgslaboratoriet hvilken dato skiftet er foretaget. Det noteres med teksten ”Skift af batch for Leja-4 kamre – ny batch er <det fulde Batch nr.>”. Det noteres med kuglepen og overstreges med speedmarker så det let kan findes når siderne i bogen bladres igennem.

Fortyndet sæd fra to forskellige batch af tre dage gamle sæddoser (gerne blandingssæd) reaktiveres og fyldes i tællekammeret som ved normal måling af sædens bevægelighed. Ved selve målingen vælges tællekammertypen ”QC Leja-4”.

Målingerne skal gennemføres som dobbeltbestemmelse for to doser – det vil sige fire separate målinger af bevægeligheden. Som donor_ID i systemet angives 0001 og 0002 som angivelse af de to forskellige sædprøver.

Data (cell data) skal trækkes ud af SpermVision systemet straks herefter og sendes til cha@dansksvineproduktion.dk. Data skal være samlet i et enkelt excel-ark og navngives efter følgende model:

<YYYYMMDD>_QCLEJA4_<Leja-4 batchnr.>.xls

YYYYMMDD angiver datoen i amerikansk format, Leja-4 batch nr. består af 13 tegn og HKS-batch nr. er sæddosens batch nr. inkl. batchdato. Således bliver en kvalitetskontrol for batch nr. 390715-260907 udført den 6. november 2007:

”20071106_QCLEJA4_390715-260907.xls”

Statistisk analyse
Data analyseres for forskel mellem to forskellige områder i tællekammeret.

En batch af tællekamre bliver kasseret, såfremt differensen mellem de to måleområder beregnes som statistisk sikkert forskellig p<0,05.

Validering af SpermVision CASA System til måling af ornesædcellers bevægelighed