I et samarbejde mellem Sektion for Reproduktion, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole, Hatting-KS, Horsens afdelingen og Odense afdelingen, samt Landudvalget for Svin, blev der gennemført en afprøvning, hvor andel levende (vita

I et samarbejde mellem Sektion for Reproduktion, Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole, Hatting-KS, Horsens afdelingen og Odense afdelingen, samt Landudvalget for Svin, blev der gennemført en afprøvning, hvor andel levende (vitale) sædceller bestemt flowcytometrisk blev sammenlignet med reproduktionsdata udtrykt som totalfødte grise per kuld og faringsprocent. Samtidig blev koncentrationsbestemmelse af sædceller bestemt på fotometer sammenlignet med flowcytometrisk koncentrationsbestemmelse.

I alt indgik 1.648 ejakulater opsamlet fra 170 Landrace- og Yorkshire orner, hvoraf oplysninger om reproduktionsdata fra avl- og opformeringsdatabasen blev erhvervet for 1.246 ejakulater med 7.786 kuld til følge.

Der blev påvist en sammenhæng mellem den målte vitalitet af sædcellerne i laboratoriet og de fundne kuldstørrelser, således at en stigning i vitalitet i råsæd på ti procent medførte en øgning i antal totalfødte grise per kuld på 0,37 gris. Det var ikke muligt at påvise en sammenhæng mellem vitalitet i råsæd og de fundne faringsprocenter.

Ved bestemmelse af sædcellekoncentrationen i råsæd målt ved flowcytometri og fotometri blev set en systematisk forskel mellem flowcytometri og fotometri, som kan beskrives ved at flowcytometeret viser 25 procent højere sædcellekoncentrationer end fotometeret.

Baggrund

En tidligere undersøgelse på Dan-Avls KS-stationer har vist en god korrelation mellem sædcellekoncentration målt ved manuel tælling og ved flowcytometri (1). Resultaterne viste også en cirka dobbelt så stor præcision af bestemmelsen af koncentrationen af sædceller ved flowcytometri, som ved brug af fotometer.

Flowcytometri er en ny metode til koncentrationsbestemmelse af sæd, der udover koncentrationsbestemmelse også kan bestemme procentdelen af vitale sædceller i et ejakulat. Princippet ved flowcytometri er, at sædceller indfarves med to forskellige farvestoffer med affinitet for sædcellens DNA. Hvis sædcellerne er vitale, optages kun det ene farvestof, hvorimod døende/døde sædceller optager begge farvestoffer. Farvestofferne i sædcellerne exciteres med laserlys, idet en tynd stråle af sædprøven passerer igennem flowcytometeret og rammes af laserstrålen. To fotoceller registrerer det emitterede lys fra de fluorescerende sædceller, og herved registreres om sædcellen er vital eller non-vital. En intern standard af fluorescerende partikler udsender et signal forskelligt fra de farvede sædceller, og herved muliggøres det samtidig, at bestemme koncentrationen af sædceller. Der tælles cirka 10.000 sædceller per prøve.

Formålet med afprøvningen var at undersøge en eventuel sammenhæng mellem procent vitale sædceller i ornesæd bestemt ved hjælp af flowcytometri i laboratoriet og reproduktionsresultater udtrykt som totalfødte grise per kuld og faringsprocent i avls- og opformeringsbesætninger under Danavl. Endvidere blev sædcellekoncentrationen i råsæd målt ved fotometri og flowcytometri, sammenlignet.

En sammenhæng mellem vitalitet og reproduktionsresultater vil kunne anvendes til at forudsige de anvendte sædcellers fertilitet og dermed medvirke til at forbedre reproduktionsresultaterne i produktionen.

Afprøvningen blev gennemført med delvis økonomisk støtte fra Dan-Avls KS-stationer og Direktoratet for FødevareErhverv¹).

Materiale og metode

Afprøvningen blev udført på Hatting-KS, Horsens og Odense afdelingerne fra juni 1999 til juni 2000., i samarbejde med Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole under Sædforskningsprojektet

Prøveudtagning

I forsøgsperioden blev der udtaget prøver fra 1.648 ejakulater opsamlet fra 170 Landrace- og Yorkshire orner, fordelt på 76 Landrace- og 94 Yorkshire orner. Af disse orner bidrog 37 orner med et ejakulat, 11 orner med to ejakulater, 13 orner bidrog med tre ejakulater, mens 115 orner bidrog med minimum fire ejakulater. En orne bidrog med op til 67 ejakulater. Gennemsnitligt bidrog hver orne med lidt over 9 ejakulater.

Ornerne blev udvalgt tilfældigt i henhold til den konkrete prøvedags springliste for navnesæd. Navnesæd indeholder kun sæd fra én orne. Prøverne blev mærket med orne identifikationsnummer, ornerace, KS-station og dato. Ornens alder på tappedagen blev ligeledes registreret, mens det ikke var praktisk muligt at få bestemt avlsindekset på ornen for den pågældende dag.

Prøverne bestod af minimum 3 ml råsæd og blev udtaget fra ejakulater udsendt til avls- og opformeringsbesætninger. Prøverne blev hældt i CRYO-rør (3,6 ml) og anbragt på et vippebord indtil analyse. De blev maksimalt opbevaret i fem minutter ved stuetemperatur inden analyse.

Bestemmelse af bevægelighed (Motilitet)

Der blev udført en bestemmelse af bevægelighed af sædcellerne på én råsædsprøve per ejakulat. Bestemmelsen blev udført i henhold til "Regler for drift og smittebeskyttelse på KS-stationer" (2).

Fotometermåling

Der blev udført fotometerbestemmelse på fotometer Corning 254 (C2807 og C2756 - et på hver KS-station) på to uafhængige råsædsprøver per ejakulat, efter følgende fortyndingsmetode:

Der blev udtaget 0,25 ml råsæd med pipette efter opblanding af råsædsprøven. Råsæden blev overført til cüvette. Herefter blev 9,75 ml EDTA-fortynder (ethylen-diamin-tetra-acetat) tilsat med dispenser, hvorefter målingen blev udført .

Flowcytometermåling

Der blev udført flowcytometrisk dobbeltbestemmelse af vitalitet og sædcellekoncentration på to uafhængige råsædsprøver per ejakulat, efter følgende metode:

Sperm Count rør blev forberedt ved tilsætning af farvestof til farvning af vitale og non-vitale sædceller i optil 131 dage (interval 2 - 131 dage, heraf var farve tilsat i optil 30 dage før i cirka halvdelen af rørene) før anvendelse.

Fra råsædsprøven blev der udtaget 20 mikroliter, som blev fortyndet til et totalvolumen på 5 ml i et PBS-medium (fosfat-buffer-opløsning) tilsat bl.a. bovint serum albumin. Fortyndingen blev foretaget med en Hamilton A503 autodiluter (Struers Kebolab, Albertslund, DK). Fra fortyndingen blev udtaget 60 mikroliter, som overførtes til et Sperm Count rør. Efter tilsætning af fortyndet sæd, placeredes Sperm Count røret på et vippebord af mærket Adams Nutator (N. C. Nielsen laboratorie udstyr), og prøven blev indfarvet i mørke i 4 minutter ved stuetemperatur. Efter indfarvning blev Sperm Count røret blev placeret i flowcytometret og analysen påbegyndtes. I flowcytometeret blev anvendt en 488 nanometer laser (blå). Efter analyse blev data lagret på en diskette i flowcytometret. Analysen blev gentaget på et nyt Sperm Count rør.

Data fra analyserne blev efterfølgende analyseret på Attractors softwareTM (Becton Dickinson, San José, USA), hvorved procent vitale sædceller og sædcellekoncentration, kunne beregnes.

Besætningsdata

Som undersøgelsesgrundlag indgik 1.648 ejakulater færdigfortyndet til sæddoser af typen navnesæd, i afprøvningen. Disse doser blev anvendt i 206 avls- og opformeringsbesætninger. Sæddoserne blev anvendt som renløbninger, hvilket vil sige, at sæd fra samme orne blev anvendt til samtlige insemineringer på samme so i samme brunst. Alene søer, som blev insemineret to gange, indgik i afprøvningen.

Reproduktionsresultater indberettet til databasen fra avl- og opformeringsbesætninger op til 30 dage efter forventet faring blev anvendt med angivelse per løbning af: dato for løbning, resultat (faring eller omløb), eventuel udsætterdato og antal totalfødte grise per kuld. Herudover blev soens alder ved løbning, soens race og indeks for kuldstørrelse (SUBFGK) registreret. Der blev anvendt det indeks på soen, som tidsmæssigt lå tættest på løbetidspunktet. Sluttelig blev sædens alder ved første insemination registreret. Søernes alder blev kategoriseret i tre grupper: under 1 år, mellem 1 og 1½ år samt over 1½ år. Dato for første løbning blev desuden anvendt til at definere en periode med niveauer: år 1999 og år 2000. Dette svarer nogenlunde til en tvedeling af materialet.

Statistisk metode - koncentration af sædceller

Følgende blev målt per ejakulat: sædcellekoncentrationveddobbeltmåling påflowcytometer og sædcellekoncentration ved dobbeltmåling på fotometer.

For et givent ejakulat blev alle fire bestemmelser udført af samme person. Præcisionen kan derfor udtrykkes som repetérbarheden. Repetérbarhedsvariansen bestemmes ved en variansanalyse af logaritmen til koncentrationen med ejakulat som tilfældig virkning og to gentagelser per ejakulat. Dette først for hele materialet, og dernæst stratificeret på person, målested og periode. Endvidere udførtes en statistisk test for, om der var forskel mellem personer, målesteder (de to KS-stationer) og perioder. Residualspredningen ved disse analyser er et direkte estimat for variationskoefficienten CV (spredningen delt med middeltallet).

Herefter beskrives sammenhængen mellem flowcytometri og fotometri. Dette gøres ved at betragte regressionen af logaritmen til forholdet mellem den fotometriske og den flowcytometrisk koncentration på logaritmen til gennemsnittet af de fire målinger. Gennemsnittet af de fire målinger er det bedste skøn over den "sande værdi" af sædcellekoncentrationen, så længe den ene af de to metoder ikke er udnævnt til at være den "sande værdi".

Statistisk metode - vitalitet af sædceller

Vitaliteten er bestemt ved dobbeltmåling (gennemsnit af to målinger) på flowcytometer, for hvert ejakulat og af samme person som har udført koncentrationsmålingerne. Vitaliteten angives som "procent vitale celler" i råsæden.

Repetérbarhedsvariansen er beregnet som residualvariansen (resvit) ved en variansanalyse af vitaliteten med ejakulat som tilfældig virkning og to gentagelser per ejakulat. Ornerace og ornens alder er anvendt som systematiske forklarende variable, såvel som periode (år 1999 og år 2000) samt målested (de to KS-stationer) og person.

For at belyse i hvilket omfang den målte vitalitet er en egenskab ved ornen, er følgende model anvendt:

Statistisk metode - sammenhæng mellem vitalitet og reproduktionsresultater

Totalfødte grise per kuld kan beskrives ved en kovariansanalyse. Karakteristika for avlsdyrene (race og alder af orne; race, lægnummer og SUBFGK-index for soen) og karakteristika for selve løbningen (alder af sæden ved første inseminering (dosisalder) og en periodeeffekt) indgår som systematiske faktorer. Orne, ejakulat og besætning indgår som tilfældige effekter, der hver beskrives ved en varians. Endelig er der en residualvariation (reskuld), som er den uforklarlige variation. Modellen ser ud som følger:

Den samme model kan anvendes til beskrivelse af faringsprocenten udtrykt som omløbersandsynligheden, forudsat at variablen "omløb ja eller nej" behandles som en kontinuert størrelse.

Sammenhængen mellem vitalitet og kuldstørrelse beskrives først ved at inkludere den observerede gennemsnitsvitalitet (to målinger) på hvert ejakulat som en forklarende regressionsvariabel. Samtidig udelades den tilfældige ejakulat effekt, således at regressionskoefficienten, ß, umiddelbart kan fortolkes som følgende: ved sammenligning af kuld "udgående" fra to ejakulater fra samme orne, der adskiller sig med x "vitalitets-procent", vil der være en gennemsnitlig forskel på ß*x %gris per kuld.

Modellen kan altså beskrives som:

En mere uddybende beskrivelse (beskrevet ved en "bivariat" model) fremkommer ved at betragte kuldstørrelsens tilfældige orne- og ejakulatvariation som noget, der delvis kan forklares ved at måle i laboratoriet. Man kan forestille sig, at der en sammenhæng mellem ornens "effekt" på kuldstørrelse og vitalitet henholdsvis, samt en sammenhæng mellem ejakulatets "effekt" på kuldstørrelse og vitalitet. Den bedst tænkelige måleparameter vil tillade en fuldstændig forudsigelse, udfra målingen, af de tilfældige orne- og ejakulateffekter på kuldstørrelsen, svarende til 100 procents korrelation mellem de tilfældige effekter. Til gengæld vil man aldrig kunne "forklare" mere af den tilfældige variation i kuldstørrelse ved målinger på det enkelte ejakulat end summen af kuldstørrelsens varianskomponenter for orne og ejakulat.

Man opnår således en sammenkobling af de to nævnte modeller for vitalitet og kuldstørrelse:

Resultater og diskussion

I alt indgik 1.648 ejakulater opsamlet fra 170 Landrace- og Yorkshire orner, der fandt anvendelse ved 13.055 løbninger. Kun 1.573 ejakulater havde data fra både flowcytometri og fotometri. For målinger ved flowcytometri er der herefter foretaget en udelukkelse af outliers fra rådata. Først er enkeltmålinger med en koncentration på over 1 mia. sædceller per ml fjernet. Dernæst er der i de tilfælde hvor forholdet mellem største og mindste dobbeltmåling af koncentrationen per ejakulat oversteg 1,65 sket en fravælgelse af begge målinger. Valget af dette forhold er gjort udfra en vurdering af hele materialet, hvor en overskridelse af forholdet 1,65 kun indtraf een ud af 1.000 gange. Herefter er der 1.451 brugbare ejakulater tilbage. Som estimat for disse ejakulaters koncentration er der så anvendt et gennemsnit af de to målinger. Kvalitetsvurderingen af sæddata er altså baseret på koncentrationsmålingerne, selvom det er den målte vitalitet, der er i fokus.

Ved beskrivelsen af sammenhængen mellem vitalitet og kuldstørrelse er der desuden valgt at se bort fra ekstreme værdier af vitaliteten, idet disse statistisk set påvirker sammenhængen uforholdsmæssigt kraftigt. Det er valgt at indskrænke analysen til ejakulater med målt vitalitet mellem 75 procent og 95 procent. Herved indgår i alt 1.246 ejakulater fra 150 orner, svarende til 86 procent af alle ejakulater med vitalitetsmåling. Der genfandtes 7.786 kuld frembragt ved løbninger med disse 1.246 ejakulater.

Koncentration af sædceller

Følgende tre histogrammer (histogram 1, 2 og 3) viser den procentvise fordeling af de målte koncentrationer ved henholdsvis flowcytometri, fotometri, samt den flowcytometrisk bestemte vitalitet. Der er i hver enkelt tilfælde angivet antal ejakulater (N), gennemsnit, median, 25 procents fraktil (nedre kvartil) og 75 procents fraktil (øvre kvartil).

Histogram 1. Koncentration i millioner sædceller per ml ved flowcytometri.

Histogram 2. Koncentration i millioner sædceller per ml ved fotometri.

Histogram 3. Vitalitetsprocent bestemt ved flowcytometri.

En sammenligning af gennemsnit i histogram 1 og 2 giver en forskel på 72 millioner sædceller per ml til fordel for måling ved flowcytometri. Det vil altså sige, at fotometri giver koncentrationsmålinger som er 72 millioner større, end for de samme prøver målt ved flowcytometri. Medianerne afviger lidt mindre, svarende til 59 millioner sædceller per ml.

Figur 1 viser samhørende værdier af sædcellekoncentration målt ved henholdsvist flowcytometri og fotometri. Der er indtegnet to linier: linien x=y og regressionslinien bestemt ved at antage et forhold på 1:4 i målestøjsvariansen for fotometri og flowcytometri. Dette forhold er hentet fra afsnittet nedenfor om variationskoefficienterne. Denne sidste linie er den linie, som bedst beskriver sammenhængen mellem resultaterne for sædcellekoncentrationen opnået ved henholdsvis fotometri og flowcytometri.

Figur 1. Samhørende værdier af sædcellekoncentration målt ved flowcytometri og fotometri.

Figur 2 viser forskellen mellem sædcellekoncentrationer målt ved flowcytometri og fotometri som funktion af gennemsnittet af målingerne ved flowcytometri og fotometri (niveauet). Det fremgår tydeligt, at der er tale om en afvigelse, der vokser proportionalt med niveauet. Des højere sædcellekoncentrationer, jo større forskel mellem de to målemetoder. Det fremgår også af figuren, at variansen på forskellen vokser med niveauet.

Figur 2. Forskellen mellem flowcytometri og fotometri som funktion af niveauet.

Figur 3 viser de to sædcellekoncentrationsmålinger ved flowcytometrien over for hinanden. Variationen ses at vokse proportionalt med niveauet.

Figur 3. Måling af sædcellekoncentration ved flowcytometri. To målinger af samme ejakulat overfor hinanden.

Tabel 1 viser de beregnede variationskoefficienter (CV 'er) opdelt efter KS-station og periode (år 1999 og år 2000, henholdsvist).

Tabel 1. CV (pct.) per station og periode. Flowcytometrisk og fotometrisk bestemmelse af sædcellekoncentrationen

KS-station

Periode
(år)

Antal dobbelt
målinger

CV (procent)
ved flowcytometri

CV (procent)
ved fotometri

Odense

1999

2000

287

178

11,0

8,5

5,9

3,5

Horsens

1999

2000

486

500

11,3

8,1

9,0

3,6

Tabel 2 viser de beregnede CV 'er for flowcytometrisk koncentrationsbestemmelse, opdelt efter operatør, her nummereret fra et til ni. Tabellen indeholder også 95 procents konfidensintervallet for den estimerede CV.

Tabel 2. CV (pct.) per operatør, ved flowcytometrisk bestemmelse af sædcellekoncentration

Operatør	Antal dobbelt- bestemmelser	CV (procent)	95 procents konfidensinterval
1	37	8,6	6,2-10,3
2	85	6,3	5,2-7,1
3	66	6,7	5,5-7,7
4	147	11,1	9,5-12,2
5	153	11,2	9,8-12,4
6	129	9,0	7,7-10,0
7	248	7,8	7,0-8,4
8	464	11,0	10,3-11,7
9	122	10,6	9,2-11,9

Udfra tabel 1 ses at målinger udført på de to KS-stationer ligger næsten ens, mens der er et statistisk signifikant fald i CV i procent fra år 1999 til år 2000. Endvidere ses en signifikant operatør variation i CV. Denne går fra godt 11 procent og ned til cirka det halve. Faldet i CV fra år 1999 til år 2000 viser sig naturligvis også for en del af operatørerne, men er ikke vist her. Der synes endvidere at være en tendens til, at operatører med mange analyser har større CV.

Tabel 3 viser CV for vitaliteten målt ved flowcytometri, fordelt på KS-station og periode.

Tabel 3. CV (procent) per station og periode.i Vitalitet bestemt ved flowcytometr

KS- station	Periode (år)	CV (procent) Vitalitet
Odense	1999 2000	2,8 2,9
Horsens	1999 2000	2,9 2,3

Af tabel 3 fremgår det, at CV for vitalitet målt ved flowcytometri ikke udviser helt samme tendens for de to stationer. For Horsens afdelingen er der et sikkert fald i CV fra år 1999 til år 2000, medens det samme ikke ses at være tilfældet i Odense afdelingen.

Overordnet for bestemmelse af sædcellekoncentrationen i råsæd målt ved flowcytometri og fotometri ses en systematisk forskel mellem flowcytometri og fotometri, som i grove træk kan beskrives ved at flowcytometeret viser 25 procent højere koncentrationer end fotometeret. Dette er selvfølgelig kun relevant for den undersøgte periode med de kalibreringer, som de to måleapparater havde på tidspunkt for afprøvningen. Når målinger på samme ejakulat gentages med flowcytometri findes en CV i procent på omkring 10. Der er dog et signifikant fald i CV i procent fra målinger udført i år 1999 sammenlignet med målinger udført i år 2000. Endvidere er der en signifikant forskel i CV i procent mellem operatørerne.

Som det bemærkes i tabel 1 og 3, ses der et fald i variationen i de forskellige parametre bestemt ved fotometri og flowcytometri fra år 1999 til år 2000. De deltagne operatører gennemgik ved udgangen af år 1999 et kursus, hvor der blev fokuseret på problemerne med kvaliteten i de forskellige analyser. Endvidere blev der i år 2000 afsat mere tid til at udføre analyserne. For målingerne med flowcytometer er det siden påvist, at de tilsatte farvestoffer får referencepartiklerne i Sperm Count rørene til at klumpe og at der derved opnås en upræcis bestemmelse af sædcellekoncentrationen, dersom farvestoffet er tilsat i for lang tid før anvendelse. I dette forsøg blev Sperm Count rør forberedt med tilsætning af farve i optil 131 dage før anvendelse.

I år 2001 blev der gennemført et forsøg til dokumentation af præcisionen ved bestemmelse af sædcellekoncentration ved fotometri og flowcytometri (3). Forsøget inkluderede endvidere tælling i Thomahæmacytometer og Burker-Türk hæmacytometer (begge tællekamre).

Forsøget blev endvidere udført med Sperm Count rør, som blev tilsat farve umiddelbart før anvendelse, og den samlede CV for dobbeltbestemmelsen på 50 ejakulater (100 analyser) var på 2,7 procent. Spredningen i forhold til sædcellekoncentrationen i tællekammer var lavest for flowcytometri (± 10 mio. per ml) i forhold til fotometri (± 55 mio. per ml).

Variationskilder for vitaliteten i råsæden

Variantionskilder for vitaliteten i råsæden - Baseret på 1.246 ejakulater fra 150 orner fordelt på 70 Landrace- og 80 Yorkshire orner, findes følgende effekter på den målte vitalitet. Enheden er udtrykt i vitalitetsprocentpoint.

Tabel 4. Variationskilder for flowcytometrisk vitalitet

Systematisk Effekt	Estimat	p-værdi	95 procents konfidensinterval
Ornerace Yorkshire / Landrace	1,19	0,016	0,21 - 2,15
Ornealder (år)	-2,04	<0,0001	-1,04 - -3,04
Tilfældige effekter	Spredning	Varians	Procent af tilfældig variation
Orne	2,52	6,36	31,5
Ejakulat	2,95	8,69	43,0
Målestøj	2,27	5,15	25,5
I alt	4,49	20,2	100

Effekten af ornealder er faktisk ikke ens, når Yorkshire orner sammenlignes med Landrace orner, idet faldet på 2,04 procentpoint dækker over fald på henholdsvis 1,01 for Landrace orner, mens det tilsvarende fald for Yorkshire orner er på 3,67. Det fremgår endvidere, at variationen fra ejakulat til ejakulat overstiger variationen fra orne til orne. Dette betyder blandt andet, at man skal have målt på en del ejakulater, for en given orne, for at vide hvor ornen ligger med hensyn til procent vitale sædceller.

Variationskilder for kuldstørrelsen udtrykt som totalfødte grise per kuld.

Baseret på 7.786 løbninger med faring, udgående fra 150 orner og 1.246 ejakulater, finder man følgende effekter på totalfødte grise per kuld. Enheden er udtrykt i antal grise per kuld.

Tabel 5. Variationskilder for kuldstørrelse. Antal totalfødte grise per kuld

Systematisk Effekt	Estimat	P-værdi	95 procents konfidensinterval
Ornerace Yorkshire / Landrace	0,66	<0,0001	0,34 - 0,98
Sorace Yorkshire / Landrace	0,87	<0,0001	0,65 - 1,09
Dosisalder 1 / (2+3) døgn	0,69	<0,0001	0,34 - 1,04
Læg 3 / 1	1,78	<0,0001	1,58 - 1,98
Periode år 2000 / år1999	0,43	<0,0001	0,22 - 0,64
SUBFGK	1,21	<0,0001	1,04 - 1,38
Tilfældige effekter	Spredning	Varians	Procent af variation
Orne	0,64	0,407	3,5
Ejakulat	0,49	0,238	2,0
Besætning	0,47	0,224	1,9
Restvariation	3,29	10,81	92,6
I alt	3,41	11,68	100 %

Effekten knyttet til SUBFGK bør i princippet være 1, men da der selvfølgelig både er tilfældig variation og en forventelig bias knyttet til det ikke-randomiserede design af studiet, kan den fundne værdi på 1.21 næppe anses for urimelig.

Som det fremgår, udgør restvariationen 93 procent af den tilfældige variation. Summen af orne- og ejakulateffekt på kuldstørrelsen udgør kun godt samlet 5 procent af variationen. Det er altså maksimalt disse godt 5 procent af variationen man vil kunne påvirke ved målinger på råsæden. Værdien af vitalitet målt ved flowcytometri skal altså bedømmes udfra, hvor stor en del af disse godt 5 procent af den totale tilfældig variation, der kan forklares. Nedenstående viser effekt af vitalitet på totalfødte grise per kuld.

Beskrivelse af kuldstørrelse (antal totalfødte grise) med vitalitet som forklarende variabel

De øvrige systematiske effekter er også med i modellen, som ovenfor, men udelades her i tabellen, idet estimater og konfidensintervaller kun påvirkes marginalt.

Tabel 6. Kuldstørrelsen med flowcytometrisk vitalitet som forklarende variabel

Systematisk Effekt	Estimat	P-værdi	95 procents konfidensinterval
Vitalitet, per procent point	0,0373	<0,0006	0,0 - 0,0586
Tilfældige effekter	Spredning	Varians	Procent af tilfældig variation
Orne	0,64	0,415	3,6
Besætning	0,48	0,233	2,0
Restvariation	3,31	11,007	94,4
I alt	3,41	11,66	100 %

Estimatet 0,037 totalfødte gris per kuld per vitalitets procentpoint er et mål for den prædiktive værdi af at kende den flowcytometrisk målte vitalitet. Med andre ord: hver gang vitaliteten i råsæd stiger med ti procent i vitalitet, øges antal totalfødte grise per kuld med 0,37.

Endelig kan man sammenligne de opnåede effekter med, hvad man ville opnå med motiliteten som bestemmende faktor i stedet for vitaliteten. Her er forskellen, at motiliteten egentlig kun forekommer på to niveauer: et niveau på 90 procents motile sædceller og et niveau på 70 eller 80 procents motile sædceller. Cirka 83 procent af de undersøgte kuld var fremkommet ved anvendelse af sæd med motilitet 90, og 17 procent altså med motilitet 70 eller 80. Den estimerede forskel i kuldstørrelse mellem disse to grupper var ca. 0,21 gris. Effekten tenderer signifikant niveau. For at opnå en direkte sammenligning med vitaliteten, kan ejakulaterne deles i to grupper: en "lav-vital-gruppe" udgørende de 17 procent af lavest vitalitet, og resten i en "høj-vital-gruppe". Effekten af denne gruppering kan estimeres til 0,25 gris. Effekten tenderer signifikant niveau.

Samtidig beskrivelse af kuldstørrelse (antal totalfødte grise) og vitalitet

Vitalitets- og kuldmodellen kan, som nævnt i metodeafsnittet ovenfor, opfattes som dele af én fælles model, knyttet sammen af korrelationer mellem orne- og ejakulat-effekter. Samtlige systematiske effekter bliver så igen estimeret, og man finder værdier tæt på de ovenfor angivne. Dette gælder også estimaterne for tilfældige effekter i de to modeller.For vitaliteten finder man således en ornevarians på 6.13 (6.36 ovenfor) og en ejakulatvarians på 8.65 (8.69 ovenfor). For kuldstørrelse finder man en ornevarians på 0.416 (0.407 ovenfor) og en ejakulatvarians på 0.260 (0.238 ovenfor). Dette er alt sammen forventeligt. Det interessante er korrelationerne. Man finder følgende:

Tabel 7. Korrelationer mellem vitalitetens og kuldstørrelsens tilfældige orne- og ejakulateffekter

Tilfældig effekt	Korrelations estimat Pvit, kuld	P2 vit, kuld	95 procents konfidensinteval for Pvit, kuld
Orne	0,278	0,077	0,113 - 0,443
Ejakulat	0,240	0,058	0,107 - 0,373

p2vit, kuld er et mål for, hvor meget variationen i f.eks. orneeffekten på kuldstørrelse reduceres ved kendskab til orneeffekten på vitaliteten. Udfra de estimerede varianser og kovarianser kan man så se på et tilfældigt valgt kuld fra et tilfældigt valgt ejakulat fra en tilfældig valgt orne og dernæst udregne korrelationen mellem kuldstørrelsen og vitalitetsmålingen på råsæden. Man kan estimere denne korrelation til ca. p=0,05.

Faringsprocent, koncentration af sædceller og vitalitet

Den samme model som beskrevet for totalfødte grise per kuld er anvendt til beskrivelse af faringsprocenten udtrykt som sandsynligheden for omløb. Resultatet heraf viser, at det ikke var muligt at påvise nogen sammenhæng mellem procent vitale sædceller i råsæden og omløb. Endvidere blev der heller ikke påvist en sammenhæng mellem sædcellekoncentration og faringsprocent.

Konklusion

I alt indgik 1.648 ejakulater opsamlet fra 170 Landrace- og Yorkshire orner, hvoraf oplysninger om reproduktionsdata fra avl- og opformeringsdatabasen blev erhvervet for 1.246 ejakulater resulterende i 7.786 kuld.

Der blev påvist en sammenhæng mellem den målte vitalitet af sædcellerne i laboratoriet og de fundne kuldstørrelser, således at en stigning i vitalitet i råsæd på ti procent medførte en forøgelse af antal totalfødte grise per kuld på 0,37 gris. Det var ikke muligt at påvise en sammenhæng mellem vitalitet i råsæd og de fundne faringsprocenter.

Samtidig blev det påvist, at alene fem til seks procent af den tilfældige variation i kuldstørrelsen kunne tilskrives egenskaber ved den konkrete orne eller ejakulat. Fem til ti procent af disse fem procent "kan forklares" ved kendskab til den flowcytometrisk bestemte vitalitet på råsæden.

Ved bestemmelse af sædcellekoncentrationen i råsæd målt ved flowcytometri og fotometri sås i denne undersøgelse en systematisk forskel mellem flowcytometri og fotometri, som groft kan beskrives ved at flowcytometeret angav 25 procent højere koncentrationer end fotometeret.

Afprøvningen er gennemført i samarbejde med:
Konsulent Helle Palmø, Afd. for Avl og Opformering, Landsudvalget for Svin
Laboratorieansvarlig Susanne Christensen, Hatting-KS, Horsens afdelingen
Laboratorieansvarlig Lis Rasmussen, Hatting-KS, Odense afdelingen

* * * * *

¹) Direktoratet for FødevareErhverv, journal nr. 935-2465-Å97-0705

Referencer

1.	Madsen, Mads Thor (2001). Koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved flowcytometri. Meddelelse nr. 514, Landsudvalget for Svin
2.	Regler for drift og smittebeskyttelse på KS-stationer. 1999, Landsudvalget for Svin
3.	Validation of the FACSCount AF SYSTEM for determination of sperm concentration in boar semen. Hansen, C., Christensen P., Stryhn H., Hedeboe AM., Rode M., Boe-Hansen G. 2002. Reproduction in Domestic Animals. In press

Vitalitetsbestemmelse af ornesæd ved flowcytometri