Formålet med forsøget var at få et indtryk af mulighederne for at iværksætte en overvågning med RT-PCR på sæd fra KS-stationerne.

Formålet med forsøget var at få et indtryk af mulighederne for at iværksætte en overvågning med RT-PCR på sæd fra KS-stationerne.

PCR-metodens specificitet (evne til at undgå falske positive reaktioner) er tidligere afprøvet på sæd fra 400 PRRS negative orner. Der sås ingen positive reaktioner, hvilket vil sige, at specificiteten er meget tæt på 100% (forekomsten af falske positiver er meget tæt på 0%).

Metodens analytiske sensitivitet (følsomhed) er i laboratoriet målt til mellem 1 og 10 TCID50, hvilket svarer til at sæd med mere end 100-500 PRRS-virus (smittefarlige/levende eller ikke smittefarlige/døde) oftest vil blive opdaget af metoden.

Metodens diagnostiske sensitivitet (evnen til at finde sandt positive orner) er på grund af det relativet lille antal orner i forsøget bestemt med en væsentlig usikkerhed. Hos 6 af 16 orner fandtes med PCR virus i sæd, svarende til 40%. Bedømt på et større antal orner vil sensitiviteten næppe være over 80%.

Forsøgets forløb

16 PRRS-negative orner blev sat i kontakt med akut PRRS-smittede fravænnede grise. Der blev to gange om ugen udtaget blodprøver og opsamlet sæd fra ornerne. Efter 2 måneder nedsattes hyppigheden af prøveudtagningen til en gang om ugen og kun hos orner, der havde vist virus i sæden.

Der gik overraskende lang tid inden ornerne blev positive i blodprøverne (1-2 måneder). Det var heller ikke forventet, at kun 40% af ornerne fandtes at udskille virus i sæd, idet 100% af orner, der podes med virus i næsen, udskiller virus. Forskellen kan skyldes, at direkte podning i næsen udsætter ornerne for et højere smittepres end det har været tilfældet i dette forsøg, hvor smitten er overført naturligt. Endelig kan der være forskel på enkelte virusstammers evne til at slå an.

Hos 3 af ornerne fandtes kun virus i sæden en gang, hos en orne fandtes virusudskillelse 3 dage, mens de sidste 2 orner udskilte virus over en måned (den ene på 2 forskellige dage, den anden på 7 forskellige dage).

Konklusion

Virusudskillelsen begynder 3-7 dage før blodprøverne bliver positive. Der er stor forskel mellem orner på udskillelsesperiodens længde (fra få dage til en måned).

Alle ornerne i dette forsøg udskilte lave mængder virus sæden. Virusmængder i dette niveau har ikke vist sig smittefarlige i eksperimentelle undersøgelser, der dog har været baseret på amerikanske virustyper og brunstsynkroniserede søer. Hvorvidt andre omstændigheder eller en anden virusstamme ville have givet højere virusudskillelse, kan ikke vides med sikkerhed.

Flere af ornerne udskilte virus ved flere end en lejlighed.

Da ornerne udskiller virus i sæd inden blodprøver bliver positive, kan en infektion principielt opdages tidligere med PCR-metoden end med blodprøver. På grund af den lave diagnostiske sensitivitet (evne til at finde sandt positive orner) kan man ikke være sikker på at finde samtlige sædportioner med virusindhold.

Slutrapport:

Analyser af prøver fra Danske Slagteriers PRRSV smitteforsøg på forsøgsstation Sdr. Rind, udført af Statens Veterinære Institut for Virusforskning, Lindholm

Baggrund og formål

Forekomst af PRRS i Danmark forårsaget af europæisk PRRS-virus er siden de første tilfælde i 1992 steget år efter år. En vaccinationskampagne med svækket levende, amerikansk vaccine har ikke kunnet påvirke udviklingen i positiv retning. Siden 1996 har dette vaccinevirus af amerikansk type selvstændigt voldt problemer, både i vaccinerede besætninger og besætninger der ufrivilligt er blevet smittet. Ifølge en opgørelser fra DANSKE SLAGTERIR (Mortensen og Barfod 1999) er 43% af sobesætningerne og 48% af slagtesvinebesætningerne smittet. Udviklingen tyder på, at stigningen vil fortsætte til i nærheden af 70% smittede besætninger.

Avls- og opformeringsbesætninger er siden 1994 blevet overvåget med månedlige blodprøver for at forhindre utilsigtet overførsel af PRRS-virus med salg af avlsdyr. Der smittes 7-8% af besætningerne i løbet af et år. Smitte med vaccine-virus er i det seneste år blevet næsten ligeså hyppig som smitte med europæisk virus. Ved smitte nedsættes besætningernes mulighed for at sælge avlsdyr og mange holder derfor op eller sanerer. På grund af saneringer og erstatning af smittede besætninger med ikke smittede, er antallet af frie avls- og opformeringsbesætninger holdt på ca. 220 i perioden 1994 til 1998.

KS-stationerne er i de senere år udelukkende drevet som PRRS-negative på grund af aftagernes modvilje mod at løbe en (lille) risiko for smitte med PRRS via sæd. Det kontrolleres ved månedlige blodprøver af stationerne forsat er negative. Alle dyr der indsættes på stationerne gennemgår ophold og blodprøvning i karantæne og isolationsstald, hvorfor en smitte af de negative stationer med indsatte dyr hidtil er blevet undgået.

I ét tilfælde er der sket smitte med vaccinevirus på en KS-station, formentlig via luftbåren smitte.

En positiv KS-station sideløbende med negative stationer har været forsøgt, men efterspørgslen har ikke være tilstrækkelig. Det er muligt ved hjælp af smittebegrænsende besætningsdrift og karantæneforanstaltninger, at producere PRRS-frie orner fra smittede besætninger. Der er således mulighed for, at smittede besætninger kan deltage i indsættelse af orner på KS-station om end med øgede udgifter og besvær i forhold til ikke-smittede besætninger.

Ved nysmitte med PRRS-virus udskiller orner virus i sæden fra 3-4 dage efter smitten i nogle uger. Derefter falder udskillelsen og ophører. Der er dog observationer, der tyder på, at der muligvis senere i ornernes liv kan finde fornyet virusudskillelse sted. Hvor ofte og i hvor store mængder dette sker vides ikke. Virus kan påvises i forskellige organer hos smittede orner i op til et halv år, hvorfor en fornyet aktivering og udskillelse er en mulighed.

Formålet med denne rapport er at:
   (i)  beskrive Sdr. Rind infektionsforsøgets forløb
    (ii) uddybe de tidligere fremlagte resultater, og rapportere nye, supplerende resultater
    (iii) diskutere og kommentere de samlede resultater fra Sdr. Rind infektionsforsøget.

Metoder

RNA, ribonuklein syre

Genomet af porcin reproduktions- og respirationssygdom virus (PRRSV) består af RNA (ca. 15.000 nukleotider langt). RNA er et meget labilt molekyle, der let nedbrydes i kliniske prøver. Detektion af RNA ved hjælp af RT-PCR stiller derfor meget høje krav til prøveforberedelse og prøveforsendelse. I Sdr. Rind infektionsforsøget blev sædprøver forsendt til Lindholm i en speciel buffer (Guanidin thiocyanat, beskrevet i reference nr. 4), der sikrer RNA mod nedbrydning.

RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction

Metode til påvisning af RNA, i dette tilfælde PRRSV RNA. Sæd sendt fra Sdr. Rind i guanidin thiocyanat buffer blev undersøgt på Lindholm for tilstedeværelse af PRRSV RNA ved RT-PCR. RT-PCR testen udført på Lindholm inolverer 4 trin: (i) oprensning af RNA fra det materiale der ønskes undersøgt, i dette tilfælde sæd, (ii) revers transkription af RNA til cDNA, (iii) PCR på cDNA'et med PCR primere, der er specifikke for PRRSV, (iv) analyse af PCR reaktioner med en oligonukleotid probe, der er specifik for PRRSV.

RT-PCR på sæd og efterfølgende analyse af RT-PCR reaktioner med en specifik oligonukleotid probe er udviklet på Lindholm, og beskrevet i detaljer i referencer nr. 4 og 5. Testen er meget specifik, der sås ingen falsk-positive reaktioner i 74 poolede sædprøver, der repræsenterende ca. 400 kendt PRRSV-negative orner (reference nr. 5). Baseret på undersøgelse af ornesæd der er tilsat cellekultur PRRSV af kendt titer, er sensitiviteten af Lindholms RT-PCR 1-10 TCID50 (tissue culture infectious dose 50)/ml sæd. Dvs. sæd der indeholder 10 TCID50 PRRSV/ml vil altid, og sæd der indeholder 1 TCID50 PRRSV/ml vil oftest, give positiv reaktion ved den RT-PCR der udføres på Lindholm. 1 TCID50 PRRSV svarer til cirka 100-500 RNA molekyler (reference nr. 10).

RT-PCR testen, som den udføres på Lindholm, inkluderer altid positive og negative kontroller, der undergår alle testtrin (RNA ekstraktion, cDNA syntese, PCR, hybridisering) parallelt med de ukendte sædprøver. Negative kontroller består af sæd fra orner der er kendt PRRSV negative. Positive kontroller består af PRRSV-frit ornesædsæd, som er tilsat cellekultur-deriveret PRRSV til en slutkoncentration af 10 TCID50 PRRSV/ml sæd (stærk positiv kontrol) og 1 TCID50 PRRSV/ml (svag positiv kontrol). Testresultatet for ukendte sædprøver accepteres kun, hvis de negative og positive kontroller giver det forventede reaktionsmønster.

Sensitiviteten af Lindholms RT-PCR er sammenlignelig med RT-PCR metoder publiceret fra andre laboratorier (reference 11, RT-PCR sensitivitet = 10 exp2,5 TCID50/ml; reference 12, RT-PCR sensitivitet = 10 TCID50/ml). RT-PCR testen udviklet på Lindholm har i en vis grad også været anvendt af udenlandske laboratorier (se f.eks. reference nr. 14). Med "nested" RT-PCR metoder ville der måske kunne opnås bedre sensitivitet, men "nested" RT-PCR er en væsentligt mere tidskrævende og kompliceret test, og er ydermere tilbøjelig til at give falsk-positive resultater (reference nr. 13). Med "real-time" (kvantitative) RT-PCR metoder vil der måske kunne opnås bedre sensitivitet, uden de kontaminationsproblemer der er med "nested" PCR (reference nr. 14, og upublicerede data fra Lindholm).

RT-PCR påviser både infektiøst RNA (fra viruspartikler) og non-infektiøst RNA (fra f.eks. virale "messenger" RNA, eller fra ufærdige og defekte virus partikler). Et positivt RT-PCR resultat er derfor ikke ensbetydende med tilstedeværelse af infektiøst PRRSV.

ELISA, enzyme linked immunosorbent assay

Metode til påvisning af antistoffer mod PRRSV i serum. Den blokerende ELISA der er anvendt til analyse af ornesera anvendes i rutinediagnostikken på Lindholm, og er beskrevet i referencer nr. 2 og 3. Resultatet angives som en "OD%", der udregnes som OD% = 100-blokering%. OD% under 50 er ensbetydende med positivt testresultat (serum indeholdt anti-PRRSV antistoffer). Jo lavere "OD%" værdi, jo flere anti-PRRSV antistoffer har der været i serumprøven.

IPT, immun peroxidase test

Metode til påvisning antistoffer mod PRRSV i serum. Testen udføres som en del af rutine PRRSV diagnostikken på Lindholm. Sera bliver testet i 1:50, 1:250, 1:1250 og 6250 fortynding, og den fortynding hvor der stadigt ses specifik reaktion angives som titerværdi for det pågældende serum. Jo højere titerværdi (1:6250 er en højere titerværdi end 1:50), jo flere anti-PRRSV antistoffer har der været i serumprøven.

Forsøgets forløb

Sdr. Rind infektionsforsøget startede d. 21 september 1999, hvor PRRSV-negative orner blev sammenblandet med akut PRRSV-inficerede grise. De PRRSV-inficerede grise opholdt sig i rensegangen til ornestierne, med trynekontakt til ornerne. Det var fra starten tilstræbt, at der skulle indgå mindst 10 PRRSV-negative orner i Sdr. Rind infektionsforsøget. 16 orner (nr. 100 til 115) indgik i forsøget d. 21 september 1999. Det drejede sig om orner udsat fra KS stationer på grund af for lavt index, men som var trænet i at springe. Med tiden faldt en del orner fra, primært på grund af benproblemer. Fra 16 november 1999 blev der blev derfor suppleret med 6 unge orner fra karantænestald (nr. 116 til 121). Disse orner var ikke trænet i at springe, og det lykkedes derfor ikke at få sæd fra alle disse orner inden serokonvertering.

I perioden 21 september 1999 til 1 februar 2000 blev der 2 gange om ugen udtaget blodprøver, og om muligt opsamlet sæd, fra ornerne. Fra 1 februar 2000 blev både udtagning af blodprøver og opsamling af sæd nedsat til 1 gange om ugen, og reduceret til at omfatte kun de orner, havde udskilt virus RNA i sæd.

De første blod- og sædprøver blev udtaget den 21 september 1999, dvs. før ornerne blev inficeret. De sidste blodprøver, der er undersøgt på Lindholm, er udtaget den 7 marts 2000. De sidste sædprøver, der er undersøgt på Lindholm, er udtaget 29 februar 2000.

I alle resultater nedenfor refererer datoer til udtagelse af prøver på Sdr. Rind.

Resultater og diskussion

Serologi

Der gik overraskende lang tid, 1-2 måneder, fra kontakt til PRRSV-inficerede grise blev etableret, til der skete serokonvertering hos de oprindeligt indsatte 16 orner. Den første orne der serokonverterede var nr. 103, den 22 oktober 1999. Derefter serokonverterede orner 101 (9 november 1999) og 105 (12 november 1999). Derefter begyndte mange orner at serokonvertere. Alle de oprindeligt indsatte 16 orner havde dog først serokonverteret d. 23 november 1999.

Gruppen af 6 unge orner som blev indsat d. 16 november 1999 serokonverterede hurtigt, formodentligt fordi de netop blev indsat på det tidspunkt hvor de fleste af de oprindeligt indsatte orner var akut inficerede, og derfor udskilte virus. Serokonvertering i denne gruppe sås først hos orne 116 (26 november 1999), orner 119, 120 og 121 serokonverterede 30 november 1999, og de sidste orner i denne gruppe, 117 og 118, serokonverterede 7 december 1999. Den hurtige serokonvertering i denne gruppe viste sig imidlertid uhensigtsmæssigt for forsøget, idet flere af de unge orner dermed ikke nåede at lære at springe inden serokonvertering, og der blev således ikke opsamlet sæd fra disse orner på det optimale tidspunkt for virusudskillelse i sæd.

RT-PCR på sæd

Grundet praktiske omstændigheder er der nogle orner, som Lindholm slet ikke har modtaget sæd fra. Andre orner har det ikke været muligt at tage sæd fra inden serokonvertering. I alt er der modtaget sæd fra 15 orner i et omfang, der tillader analyse af udskillelsen af virus RNA i sæd (orner 100, 101, 103, 104, 105, 108, 109, 110, 111, 115, 117, 118, 119, 120, 121).

Alle disse 15 orner var PRRSV-inficerede (dvs. serokonverterede mod PRRSV). Blandt disse 15 undersøgte orner, blev der påvist PRRSV RNA i sæd ved RT-PCR for 6 orner (104, 105, 109, 111, 119 og 120).

Det blev således påvist at 6/15 = 40% af ornerne i Sdr. Rind infektionsforsøget udskilte PRRSV RNA i sæd.

Som ovenfor nævnt, sandsynliggjorde serokonvertering data at de nye orner der blev indsat 16 november 1999 var udsat for et større smittepres end den oprindelige gruppe af orner indsat 21 september 1999. Dette kunne tænkes at have indflydelse på, hvor mange dyr der endte med at udskille PRRSV RNA i sæd. Af den oprindelige gruppe orner kunne udskillelse af virus RNA i sæd analyseres for dyr 100, 101, 103, 104, 105, 108, 109, 110, 111 og 115. Orner 104, 105, 109 og 111 udskilte PRRSV RNA i sæd, dvs. 4/10 = 40%. Af den nye gruppe orner kunne udskillelse af virus RNA i sæd analyseres for dyr 117, 118, 119, 120 og 121. Orner 119 og 120 udskilte PRRSV RNA i sæd, dvs. 40%. Sammenligning mellem de 2 grupper af orner skal tages med forbehold, idet der var forskel fx i dyrenes alder. Ikke desto mindre var der ikke forskel på frekvensen af dyr, der udskilte PRRSV RNA i sæd, mellem de 2 grupper af orner. Det skal understreges, at disse fund ikke udelukker, at den infektionsdosis som en orne udsættes for kan have indflydelse på udskillelse af PRRSV RNA i sæd.

Det vides ikke, hvad der er bestemmende for, om en orne der er PRRSV-inficeret udskiller PRRSV RNA i sæd. En mulig hypotese er, at dyr der udskilte PRRSV RNA i sæd er dem der er blevet inficeret med stor mængde virus, og at sådanne dyr måske også ville udvise en hurtig serokonvertering. I tabellen nedenfor er serokonvertering og tilstedeværelse af PRRSV RNA i sæd sammenholdt for de 15 orner, for hvilke en sådan analyse var mulig. I tabellen er angivet datoen for den første serumprøve der var positiv for anti-PRRSV antistof, uanset test (IPT eller ELISA). Bemærk at de 15 orner vist i tabellen indeholder både dyr fra den oprindelig gruppe af orner, der blev blandet med PRRSV-positive grise 21 september 1999 (numre 100-115), og dyr fra den nye gruppe af orner, indsat 16 november (numre 116-121). Som det fremgår af tabellen nedenfor, var der ingen sammenhæng mellem hastigheden hvormed ornerne serokonverterede, og udskillelse af PRRSV RNA i sæd. Igen bør det understreges, at disse fund ikke udelukker at infektionsdosis, som en orne udsættes for, kan have indflydelse på udskillelse af PRRSV RNA i sæd.

Orne nummer	Serokonvertering dato	PRRSV RNA i sæd?
100	23 november 1999	nej
101	9 november 1999	nej
103	22 oktober 1999	nej
104	23 november 1999	JA
105	12 november 1999	JA
108	23 november 1999	nej
109	23 november 1999	JA
110	23 november 1999	nej
111	19 november 1999	JA
115	19 november 1999	nej
117	7 december 1999	nej
118	7 december 1999	nej
119	30 november 1999	JA
120	30 november 1999	JA
121	30 november 1999	nej

Sammenligning af Sdr. Ring RT-PCR resultater med resultater fra et tidligere forsøg udført på Lindholm

Det var overraskende, at kun 40% af ornerne i Sdr. Rind infektionsforsøget fandtes at udskille PRRSV RNA i sæd. Det er tidligere beskrevet, at 100% af orner udskiller PRRSV RNA i sæd efter oronasal infektion med cellekultur deriveret PRRSV (referencer nr. 6 og 7). Vi har tidligere vist, at fem ud af fem orner (1-1,5 år gamle) oronasalt inficeret med 10 exp6,2 TCID50 af europæisk-type PRRSV 18794/93 udskilte PRRS RNA i sæd (referencer 1 og 5). Sæd fra disse orner blev undersøgt med den samme RT-PCR test der blev anvendt til sædprøverne fra Sdr. Rind, og RT-PCR resultaterne er vist i tabellen nedenfor (data taget fra reference 5). Den lave frekvens af orner i Sdr. Rind infektionsforsøget der udskilte PRRSV RNA i sæd, kan skyldes at ”smittedosis” ved den ”naturlige” smittegang i dette forsøg har været betydelig mindre, end den som er anvendt ved oronasal podning med højtitret PRRSV i reference 1 og 5. En anden mulig forklaring kan være virulensforskel mellem virus isolatet, som er anvendt i podningsforsøget, og isolatet som har cirkuleret i Sdr. Rind.

RT-PCR på sæd fra 5 orner eksperimentelt inficerede med europæisk-type PRRSV 18794/93 (data fra reference nr. 5)

Orne	0 dpi	4 dpi	7 dpi	10 dpi	14 dpi	21 dpi	28 dpi	35 dpi	42 dpi
1616	-	-	-	+	+	+	-	-	-
1666	-	-	+	-	+	-	-	-	-
5652	-	-	-	-	+	-	-	-	+
5691	-	+	-	+	+	-	-	-	+
5719	-	+	-	-	-	+	+	+	-

"dpi": dag efter eksperimentel PRRSV infektion. "-": negativt RT-PCR resultat på sæd. "+": positivt RT-PCR resultat på sæd.

Samlet analyse for de 6 orner, som fandtes at udskille PRRSV RNA i sæd

Sæd fra de 6 orner der udskilte PRRSV RNA i sæd blev undersøgt til og med mindst 8 uger efter sidste positive sædprøve.

For hver af de 6 orner der udskilte PRRSV RNA i sæd, er serologi og RT-PCR data vist i figurer placeret bagerst i denne rapport.

For at præsentere IPT, ELISA og RT-PCR data i samme søjlediagram for hver orne, er følgende scores blevet brugt for resultaterne fra de enkelte tests:

IPT. IPT udført, med negativt resultat: score = 0. IPT udført, med positivt resultat: score = titer af anti-PRRSV antistof. IPT ikke udført (fordi serum ikke var tilgængeligt for pågældende tidspunkt, eller fordi tidspunktet ikke fandtes relevant baseret på resultater fra andre tidspunkter): ingen score (ingen søjle).

ELISA. ELISA udført, med negativt resultat (dvs. prøver med OD% > 50): score = 0. ELISA udført, med positivt resultat: score = OD% x 10 (dvs. en lav score indikerer et højt niveau af antistof). ELISA ikke udført (fordi serum ikke var tilgængeligt for pågældende tidspunkt, eller fordi tidspunktet ikke fandtes relevant baseret på resultater fra andre tidspunkter): ingen score (ingen søjle).

RT-PCR på sæd. RT-PCR udført, med negativt resultat: score = 0. RT-PCR udført, med positivt resultat: score = 100. RT-PCR ikke udført (oftest fordi sæd ikke var tilgængelig for pågældende tidspunkt): ingen score (ingen søjle).

RT-PCR og serologi data (opsummeret figurerne i figurafsnittet bagerst i denne rapport) giver anledning til nogle observationer, der kunne være relevante for overvågning af orner på KS stationer. Disse observationer er derfor fremhævet i (i)-(vi) nedenfor:

(i) De 6 orner der udskilte virus RNA i sæd fordelte sig således mht. udskillelses længde:

Udskillelses længde (tidsinterval mellem første og sidste RT-PCR positive sædprøve)	Orne nummer
1 dag (kun en positiv sædprøve)	105, 119, 120
3 dage	109
1 måned	104, 111

Dvs. at der var en høj grad af variation mellem orner i hvor længe PRRSV RNA blev udskilt i sæden. Dette resultat var forventet, baseret på publicerede studier hvor orner blev eksperimentelt inficeret med PRRSV af amerikansk type (referencer nr. 6 og 7) eller europæisk type (referencer nr. 1 og 5).

(ii) De 6 orner der udskilte virus RNA i sæd fordelte sig således mht. udskillelses hyppighed:

Antal sædprøver, der var positive for virus RNA	Orne nummer
1	105, 119, 120
2	109, 111
7	104

Dvs. at få episoder af virusudskillelse i sæd var det mest almindelige. Det skal dog understreges at der tilsyneladende er stor variation mellem orner i udskillelses mønstret af virus RNA i sæd. Markant langvarig og hyppig udskillelse af virus blev således påvist for orne 104, der havde adskillige positive sædprøver.

(iii) Udskillelse af virus RNA i sæd forekom mest hyppigt omkring tidspunktet for serokonvertering. For orner 104, 109 og 111 kunne virus RNA detekteres i sæd 3-7 dage før serokonvertering. For orne 105 kunne virus RNA setekteres i sæd samtidigt med serokonvertering. For orner 119 og 120 kunne virus RNA først detekteres i sæd 3-10 dage efter serokonvertering. Orner 119 og 120, for hvilke virus RNA først kunne detekteres i sæd efter serokonvertering, hørte begge til gruppen af nyindsatte unge orner (se ovenfor). Der er dog for få observationer i dette forsøg til at sammenligne udskillelse af virus RNA i sæd mellem den oprindelige gruppe af orner (indsat 21 september 1999) og de unge orner indsat 16 november 1999.

(iv) Det længste interval der var fra udskillelse af virus RNA i sæd til serokonvertering var 1 uge (orner 104 og 109). Dvs. at brug af den eksisterende RT-PCR på sæd ville tillade detektion af PRRSV smitte ca. 1 uge før det er muligt med eksisterende serologiske assays, hvis orner på KS stationer blodprøves hver 7. dag. Hvis orner blodprøves med længere interval, ville fordelen af RT-PCR over serologi blive større.

(v) Den seneste sædprøve, der var positiv for virus RNA var opsamlet den 28. december (orne 104), og sæd fra alle dyr var fri for PRRSV RNA i den efterfølgende 8 ugers periode (30. december - 29. februar).

Da det længste interval mellem 2 sædprøver, der var positive for virus RNA, var ca. 1 måned (orne 111), kunne den 8 uger lange periode med RT-PCR negativt sæd tolkes som at ornerne efter initielt at have udskilt virus RNA i sæd (over RT-PCR testens detektionsgrænse), på senere tidspunkter enten udskilte virus RNA i sæd på lavere niveau (under RT-PCR testens detektionsgrænse), eller helt ophørte med at udskille virus RNA i sæd. Det kunne være attraktivt at bruge disse observationer til at opsætte regler for karantæne af PRRSV-positive eller PRRSV-vaccinerede orner. Det skal imidlertid understreges, at der fortsat er stor usikkerhed til sikkerheden ved dette af 2 årsager: (a) Udskillelsen af PRRSV RNA i sæd vides fra litteraturen at være yderst variabel mellem dyr, og at kunne finde sted i over 3 måneder efter infektion, i nogle tilfælde (reference nr. 7), (b) Trods RT-PCR negativt resultat kunne virus RNA være tilstede i sæd på lavt niveau, under RT-PCR testens detektionsgrænse.

(vi) Der kunne ikke påvises sammenhæng mellem serologiske data, hvor længe en orne udskilte virus RNA i sæd, eller hvor mange gange den udskilte virus RNA i sæd. Disse resultater demonstrerer altså, at nuværende serologiske tests, som forventet, ikke kan anvendes til at differentiere mellem orner der udskiller PRRSV RNA langvarigt, og orner der udskiller PRRSV RNA kortvarigt i sæd.

Alle sædprøver, der var positive for PRRSV RNA, var svagt positive i RT-PCR testen. Vores erfaring med denne test er, at prøver der producerer svag reaktion i RT-PCR testen ikke kan fortyndes inden analyse. For at bekræfte dette, blev alle positive sædprøver undersøgt igen, denne gang ved en modificering af den eksisterende RT-PCR test, der gør den mere kvantitativ (såkaldt fluorogen, "real-time" RT-PCR). Den modificerede RT-PCR metode havde samme sensitivitet som standard RT-PCR metoden, der er beskrevet i materialer og metoder, og som var anvendt til den indledende analyse af alle sædprøver. Re-analyse af alle positive sædprøver med "real-time" RT-PCR viste, at ingen af de positive sædprøver efter 10 gange fortynding ville blive testet positive. Enkelte prøver ville stadig give positivt resultat efter en 2-4 folds fortynding af sæden.

Virus isolation og RT-PCR på serum

For at undersøge om der havde været et almindeligt infektionsforløb i ornerne, blev en enkelt af de orner der ikke udskilte virus i sæden undersøgt for viræmi. Fra orne 100 blev blodprøver, som var udtaget i tiden omkring serokonvertering undersøgt for indhold af infektiøst PRRSV ved dyrkning i cellekulturer (porcine alveolære lungemakrofager og MARC celler). Der blev påvist viræmi fra 11 dage før serokonvertering, til 14 dage efter serokonvertering. Dyrkningsresultaterne blev bekræftet ved RT-PCR på serum. Dette er at betragte som et almindeligt forløb af serokonvertering og viræmi. Dette resultat, og resultaterne diskuteret ovenfor, viser at et normalt infektionsforløb med viræmi og serokonvertering førte til udskillelse af virus RNA i sæd for cirka 40% af dyrene, mens de resterende 60% ikke udskilte virus RNA i sæd, eller udskilte lave mængder (under RT-PCR testens detektionsgrænse).

PRRSV isolatet fra serum af orne 100 blev karakteriseret vha. monoklonale antistoffer som værende af europæisk type, i overensstemmelse med at de PRRSV-positive grise der blev brugt til at smitte ornerne kom fra en besætning positiv for europæisk type PRRSV. PRRSV isolater fra orne 100 er deponeret i Lindholms bank af PRRSV isolater (isolat numrene 42282 orne 100, 42355 orne 100, 42479 orne 100, 42541 orne 100, 42647 orne 100 og 42857 orne 100) og vil kunne karakteriseres videre i fremtiden, såfremt dette skønnes relevant.

Konklusioner, med kommentarer

Formålene for infektionsforsøget i Sdr. Rind var følgende (se Appendix):
(i) at undersøge hvornår virusudskillelse i sæd begynder
(ii) at undersøge hvor længe der udskilles virus i sæd
(iii) at undersøge den udskilte virusmængde i sæd, afhængigt af tid efter infektion
(iv) at undersøge om der sker periodevis virusudskillelse i sæd

Disse formål blev opfyldt, som beskrevet detaljeret ovenfor i "resultater og diskussion". Imidlertid blev analysen af resultaterne svagere end forventet, grundet den uventet lave mængde af inficerede orner der udskilte PRRSV RNA i sæden (kun 40%), og forskellige praktiske vanskeligheder ved forsøgets udførelse.

Der knytter sig følgende konklusioner og kommentarer til hvert af formålene:

(i), hvornår begynder virusudskillelsen i sæd ?

- Hos 3/6=50% af ornerne sås udskillelse af virus RNA i sæd 3-7 dage før serokonvertering.
- Hos en (1/6=17%) af ornerne sås udskillelse i sæd samtidigt med serokonvertering.
- Hos 2/6=33% af ornerne sås udskillelse af PRRSV RNA i sæd 3-10 dage efter
serokonvertering.

Konklusionen er, at udskillelse af PRRSV RNA i sæd ofte forekommer 3-7 dage før serokonvertering.

Disse resultater stemmer godt overens med andre studier, hvor eksperimentel infektion af orner med amerikansk-type PRRSV førte til udskillelse af PRRSV RNA 4-7 dage før serokonvertering (reference nr. 6).

(ii) hvor længe udskilles der virus i sæd ?

Udskillelses længde (tidsinterval mellem første og sidste RT-PCR positive sædprøve)	Orne nummer
1 dag (kun en positiv sædprøve)	105, 119, 120
3 dage	109
1 måned	104, 111

Konklusionen er, at der var en høj grad af variabilitet mellem ornerne mht. hvor længe PRRSV RNA blev udskilt i sæden.

Dette resultat er i god overensstemmelse med andre studier, hvor orner blev eksperimentelt inficeret med amerikansk-type PRRSV. I disse undersøgelser fandtes ligeledes, at der var høj variation mellem orner mht. hvor længe PRRSV RNA blev udskilt i sæd, og nogle orner udskilte PRRSV RNA i sæd i over 92 dage (referencer nr. 6 og 7)

Det vides ikke hvad der bestemmer, om en orne udskiller PRRSV RNA i lang eller kort tid i sæden, men der er tidligere peget på race (reference nr. 6), kønsmodenhed/testosteronproduktion ved infektion (referencer nr. 8 og 9) og tilstedeværelse af antiviralt IgA i sæd (reference nr. 5).

(iii) hvor meget virus udskilles der i sæd ?

Alle RT-PCR positive sædprøver ville være blevet negative efter en 10-fold fortynding.

Konklusionen er, at ornerne i Sdr. Rind infektionsforsøget udskilte lave mængder PRRSV RNA i sæd, tæt på RT-PCR testens detektionsgrænse.

(iv) sker der periodevis udskillelse af virus i sæd ?

Periodevis (intermitterende) udskillelse af PRRSV RNA i sæd fandtes for orner 104 og 111, dvs. for 2/6=33% af dyrene.

Orne 104 leverede RT-PCR negativt sæd i perioder på 7 og 14 dage mellem RT-PCR positive sædprøver (se figurafsnit) Orne 111 leverede RT-PCR negativt sæd i en periode på 1 måned mellem 2 RT-PCR positive sædprøver (se figurafsnit).

Konklusionen er, at for en væsentlig fraktion af orner der udskiller PRRSV RNA i sæd, er udskillelsen intermitterende.

Intermitterende udskillelse af PRRSV RNA i sæd er beskrevet for orner eksperimentelt inficeret med amerikansk-type PRRSV (f.eks. referencer nr. 6 og 7), og det var derfor forventet at tilsvarende også ville gøre sig gældende efter infektion med europæisk-type PRRSV, som i Sdr. Rind infektionsforsøget.

Afsluttende kommentarer: Sdr. Rind infektionsforsøget er specielt på 3 grundlæggende punkter: (i) udskillelse af europæisk-type PRRSV i sæd blev undersøgt (langt de fleste publicerede studier vi har kendskab til, har anvendt amerikansk-type PRRSV, bortset fra referencer nr. 1 og 5), (ii) virulensen af den i Sdr. Rind cirkulerende PRRSV stamme kendes ikke, og det er muligt at Sdr. Rind PRRSV stammen ved et tilfælde har lav tendens til udskillelse i sæd, (iii) der er sket en "naturlig" smittegang mellem ornerne (alle publicerede studier har anvendt oronasal inokulation af orner med cellekulturpasseret, højttitret PRRSV). Grundet disse forhold, er sammenligning mellem resultaterne fra Sdr. Rind og andre publicerede studier kompliceret. Ikke desto mindre stemmer resultaterne fra Sdr. Rind forsøget godt overens med publicerede studier hvad angår start af PRRSV RNA udskillelse i sæd, varighed af PRRSV RNA udskillelse i sæd, og forekomst af intermitterende udskillelse i sæd.

Den største forskel mellem resultater fra Sdr. Rind forsøget og publicerede studier angår frekvensen af orner der udskilte PRRSV RNA i sæd. I Sdr. Rind infektionsforsøget fandtes kun 40% af dyrene at udskille PRRSV RNA i sæd, hvorimod 100% af orner oronasalt inficerede med højttitret (cellekulturpasseret) PRRSV typisk udskiller virus RNA i sæd.

Perspektiver: Udskillelse af PRRSV RNA i sæd kan oftest ses tidligere end serokonvertering mod PRRSV, og RT-PCR på sæd kunne derfor være en attraktiv metode til overvågning af orner på KS stationer.

RT-PCR på sæd er imidlertid stadigt en dyr og teknisk vanskelig procedure. Stor skala anvendelse af RT-PCR på ornesæd vil kræve metodeudvikling på en række punkter, primært indenfor automatiske (robotiserede) RNAekstraktion procedurer, og nye, forbedrede PCR formater, såkaldt "real-time" (fluorogen) PCR. "Real-time" PCR metoder har generelt forbedret følsomhed, er hurtigere at udføre, er kvantitative og er mindre følsomme for krydskontamination. Udvikling af "real-time" RT-PCR metoder til PRRSV påvisning er et aktivt forskningsfelt, både i Danmark (upubliceret) og i udlandet (reference nr. 14).

Referencer

(1)	Nielsen T.L., Nielsen J., Have P., Baekbo P., Hoff J.R., Botner A. 1997. Examination of virus shedding in semen from vaccinated and from previously infected boars after experimental challenge with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet. Microbiol. 54: 101-112.
(2)	Sørensen K.J., Bøtner A., Smedegaard Madsen E., Strandbygaard B., Nielsen J. 1997. Evaluation of a blocking ELISA for screening of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus. Vet. Microbiol. 56: 1-8.
(3)	Sørensen K.J., Strandbygaard B., Bøtner A., Madsen E.S., Nielsen J., Have P. 1998. Blocking ELISA's for the distinction between antibodies against European and American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus. Vet. Microbiol. 60: 169-177.
(4)	Oleksiewicz M.B., Bøtner A., Madsen K.G., Storgaard T. 1998. Sensitive detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by RT-PCR amplification of whole viral genes. Vet. Microbiol. 64: 7-22.
(5)	Oleksiewicz M.B., Bøtner A., Normann P. 2001. Semen from boars infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) contains antibodies against structural as well as nonstructural proteins. Vet. Microbiol. 81: 109-125.
(6)	Christopher-Hennings J., Holler L.D., Benfield D.A., Nelson E.A. 2001. Detection and duration of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in semen, serum and peripheral blood mononuclear cells, and tissues from Yorkshire, Hampshire, and Landrace boars. J Vet Diagn Invest 13: 133-142.
(7)	Christopher-Hennings J., Nelson E., Hines R.J., Nelson J.K., Swenson S.L., Zimmerman J.J., Chase C.C.L., Yaeger M.J., Benfield D.A. 1995. Persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in serum and semen of adult boars. J Vet Diagn Invest 7: 456-464.
(8)	McCollum W.H., Little T.V., Timoney P.J., Swerczek T.W. 1994. Resistance of castrated male horses to attempted establishment of the carrier state with equine arteritis virus. J. Comp. Path. 111: 383-388.
(9)	Holyoak G.R., Little T.V., McCollum W.H., Timoney P.J. 1993. Relationship between onset of puberty and establishment of persistent infection with equine arteritis virus in the experimentally infected colt. J. Comp. Path. 109: 29-46.
(10)	Shin J., Bautista E.M., Kang Y.-B., Molitor T.W. 1998. Quantitation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by single-tube reverse transcription-nested polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods 72: 67-79.
(11)	Van Woensel P., Van Der Wouw J., Visser N. 1994. Detection of porcine reproductive respiratory syndrome virus by the polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods 47: 273-278.
(12)	Legay O., Bounaix S., Denis M., Arnauld C., Hutet E., Cariolet R., Albina E., Jestin A. 1997. Development of a RT-PCR test coupled with a microplate colorimetric assay for the detection of a swine Arterivirus (PRRSV) in boar semen. Journal of Virological Methods 68: 65-80.
(13)	Shin J., Torrison J., Choi C.S., Gonzalez S.M., Crabo B.G., Molitor T.W. 1997. Monitoring of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in boars. Vet. Microbiol. 55: 337-346.
(14)	Egli, C., Thür B., Liu L., Hofman M A. 2001. Quantitative TaqMan RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of Virological Methods 98: 63-75.

Appendix

Figurer:
Opsummering af serologi og RT-PCR resultater for de 6 orner, der udskiller PRRSV RNA i sæd

RT-PCR til påvisning af porcin reproduktions- og respirationssygdom virus (PRRSV) i ornesæd