Ny antibiotikakombination som tilsætning til ornesæd

Sammendrag

En ny antibiotikakombination bestående af 100 mikrogram Gentamycin og 100 mikrogram Amoxicillin per ml færdigfortyndet sæd, er blevet undersøgt som tilsætning til EDTA-fortynderen til fortynding af ornesæd. Afprøvningen bestod dels af en laboratorieundersøgelse samt afprøvning i produktionsbesætninger.

En bakteriologisk undersøgelse (bakteriedrab og resistens) af kombinationen af Gentamycin og Amoxicillin viste sig effektiv overfor mulige forekommende bakterier isoleret fra ornesæd, samt fra ornens forhud. Herudover var antibiotikakombinationen effektiv overfor Salmonella typhimurium, DT104.

Undersøgelser for negativ effekt på sædcellernes bevægelighed samt på sædcellernes akrosomalkappe af antibiotikakombinationen blev sammenlignet med en antibiotikakombination bestående af Penicillin, Streptomycin, Lincomycin og Spectinomycin (EU-cocktailen) samt Neomycinsulfat. Der sås ingen forskel mellem grupperne.

En besætningsafprøvning med otte besætninger hvor samme ejakulat blev fortyndet i EDTA-fortynderen indeholdende enten EU-cocktailen eller en kombination af Gentamycin og Amoxicillin, omfattende ca.1.400 kuld per gruppe, viste ingen statistisk sikker forskel i faringsprocent eller totalfødte grise per kuld. Tilsvarende blev der fra besætningerne ikke berettet om negativ effekt (”adverse effect”) ved anvendelse af antibiotikakombinationen i forsøgsgruppen.

Det kan konkluderes, at en kombination af Gentamycin og Amoxicillin anvendt i EDTA-fortynderen til fortynding af ornesæd kan forhindrer overførsel af mulige forekommende bakterier inklusiv Salmonella typhimurium, DT104. Den pt. anvendte EU-cocktail dræber ikke Salmonella typhimurium, DT104. Endvidere ses en neutral effekt på sædcellernes bevægelighed, akrosomalkappe samt på reproduktionsresultater udtrykt som faringsprocent og totalfødte grise per kuld.

Det må derfor anbefales at anvende en kombination af Gentamycin og Amoxicillin som tilsætning til ornesæd i stedet for den pt. anvendte EU-cocktail eller den tidligere anvendte Neomycinsulfat. Anbefalingen gælder alene salg af sæd i Danmark, da en kombination af Gentamycin og Amoxicillin ikke med sikkerhed virker overfor Mykoplasma eller Leptospirer som krævet af myndighederne ved salg af sæd uden for landets grænser.

Der er ansøgt om tilladelse til anvendelse af den nye antibiotikakombination, men tilladelse er endnu ikke givet af Fødevaredirektoratet.

Baggrund

I Danmark sælges mere end 2.600.000 sæddoser fra Danavls KS-stationer om året. For at nedbringe risikoen for overførsel af potentielt sygdomsfremkaldende bakterier tilsættes antibiotika til sæden. I ”Veterinærdirektoratets bekendtgørelse om ornesæd nr. 598 af 29. juni 1992” er krav til antibiotikumtilsætning beskrevet. Heri fastslås det, at sæd til salg i Danmark skal tilsættes Neomycin, en antibiotikakombination af Penicillin, Streptomycin, Lincomycin og Spectinomycin (EU-cocktailen) eller en antibiotikakombination med mindst tilsvarende virkning.

Indtil april 1996 blev der til færdigfortyndet sæd fra Danavls KS-stationer anvendt Neomycin, men efter en bakteriologisk undersøgelse af 50 ejakulater blev der fundet en delvis forurening af den færdigfortyndede sæd. På baggrund af dette fund blev det besluttet, at skifte antibiotika til den i bekendtgørelsen nævnte EU-cocktail. Samtidig med dette skift blev der påbegyndt en undersøgelse af mulige nye antibiotika, som med fordel kunne anvendes som tilsætning til ornesæd.

Det var et krav, at den nye antibiotika-cocktail

-	skulle forhindre overførsel af potentielt sygdomsfremkaldende bakterier via færdigfortyndet sæd fra KS-stationerne og derved mindske risikoen for resistensudvikling
-	skulle forhindre overførsel af Salmonella typhimurium, DT104
-	skulle have en neutral indvirkning på sædens holdbarhed ved bevægelighedsundersøgelser optil 96 timer, således at holdbarheden ikke er ringere end for den pt. anvendte antibiotikacocktail
-	skulle have en neutral indvirkning på sædcellens akrosomalkappe ved opbevaring optil 72 timer, således at andelen af intakte akrosomalkapper ikke er lavere end for den pt. anvendte antibiotikacocktail
-	skulle have en neutral indvirkning på reproduktionsresultaterne, således at resultaterne ikke er ringere end for den p.t. anvendte antibiotikacocktail
-	prismæssigt ikke måtte være dyrere end den pt. anvendte antibiotikacocktail per færdigfortyndede sæddoser.

I samarbejde med Institut for Farmakologi og Patobiologi, Den Kongelige Veterinær- og Landbohøjskole, Frederiksberg (KVL), blev to antibiotika fundet som værende mulige kandidater. Disse var Gentamycin og Amoxicillin og i kombination opfylder de, de stillede krav til mulige antibiotika-kandidater.

Formålet med denne afprøvning var at undersøge en antibiotikakombination af Gentamycin og Amoxicillin som tilsætning til sæd overfor alment forekommende bakterier i ornesæd, på sædskadende effekt udtrykt som sædcellernes bevægelighed og akrosomalkappe, samt på reproduktionsresultaterne i produktionsbesætninger.

Afprøvningen blev gennemført med delvis økonomisk støtte fra Dan-Avl’s KS-stationer.

Materialeog metode

Bakteriologi, drabseffekt og resistens

På baggrund af et litteraturstudium samt mikrobiologisk isolation af alment forekommende bakterier i sæd og i svaberprøver fra udposningen af ornens forhud, blev relevante bakteriearter inklusive Salmonella typhimurium, DT104, undersøgt af Statens Veterinære Serumlaboratorium, København (SVS). SVS undersøgte den bakteriedræbende effekt såvel som resistensmønsteret af bakterierne overfor Amoxicillin og Gentamycin.

Hver enkelt stamme under hver bakterieart blev dyrket i 24 timer ved 37°C i Müller-Hinton bouillon (Merck). Dernæst blev turbiditeten indstillet til 0,5 på McFarland-skalaen, hvilket svarer til en koncentration af bakterier på 1,5 x 10exp8 kolonidannende enheder (CFU) per ml. Fra denne opløsning anvendtes en koncentration på 1 x 10exp5 CFU i et total volumen på 10 ml EDTA-fortynder (ethylen-diamin-tetra-acetat) til de videre undersøgelser.

Alle stammer under hver bakterieart blev inkuberet i 24 timer ved 37°C med Amoxicillin, Gentamycin, en kombination af Amoxicillin og Gentamycin samt EU-cocktailen (kontrolgruppe). Koncentrationen af de enkelt antibiotika fremgår af tabel 1. Efter inkubation blev foretaget udstrygning af 0,5 ml suspension på overfladen af 2 blodagarplader. Pladerne blev inkuberet i 24 timer ved 37°C og derefter observeret for vækst. Som kontrol blev anvendt bakteriekultur uden antibiotika samt EDTA-fortynderen alene.

Resistensmønster for alle stammer under hver bakterieart blev bestemt ved anvendelse af Rosco Neo-Sensitabs efter standardmetode anbefalet af leverandøren. Tabletter med de enkelte antibiotika eller antibiotikakombinationer blev placeret på blodagarplader med vækst af de relevante bakteriestammer og inkuberet i 24 timer ved 37°C. Derefter blev hæmningszonerne bestemt og resistensmønsteret fastlagt.

Tabel 1. Koncentration af antibiotika anvendt i bakteriedrabs- og resistensforsøg med angivelse af leverandør

Gruppenavn	Antibiotikum	Koncentration (i totalvolumen)	Leverandør
Gentamycin	Gentamycin	100 µg/ml	Sigma
Amoxicillin	Amoxicillin	100 µg/ml	SmithKline Beecham
Gentamycin/Amoxicillin	Gentamycin/Amoxicillin	100 µg/ml 100 µg/ml	SigmaSmithKline Beecham
EU-cocktail (kontrolgruppe)	Streptomycin/Penicillin Lincomycin/Spectinomycin	500 i.e./ml 500 i.e./ml 150 µg/ml 300 µg/ml	Medicinkemi Uldum (MEKU A/S)

Bevægeligheds og akrosomalkappe-undersøgelser

I samarbejde med Hatting-KS, Ringsted afdelingen, blev sædcellernes bevægelighed bestemt og sædcellernes akrosomalkappe vurderet, henover tid.

Undersøgelsen indbefattede EU-cocktailen (kontrolgruppe 1) og antibiotikakombinationen af Gentamycin og Amoxicillin, i koncentrationer som angivet i tabel 1. Herudover blev sædcellerne også undersøgt overfor Neomycin i en koncentration på 1 mg Neomycinsulfat per ml færdigfortyndet sæd (kontrolgruppe 2). Neomycinsulfaten blev leveret af Skanderborg Apotek. Neomycin blev inddraget i undersøgelserne, da antibiotikumet tidligere har været anvendt som tilsætning til ornesæd i Danmark. I alle tre gruppe blev sæd fra samme ejakulat anvendt. Den færdigfortyndede sæd blev opbevaret ved 16-18°C. Figur 1 angiver forløbet af bevægeligheds- og akrosomalkappeundersøgelser herover tid.

Bevægeligheden af sædcellerne blev bestemt efter reaktivering og ved anvendelse af mikroskopi ved 200 ganges forstørrelse, som det rutinemæssigt bliver udført på Danavls KS-stationer, i henhold til Reglerne (1997) (1).

Undersøgelser for intakt akrosomalkappe på råsæd blev udført umiddelbart efter opsamling ved at blande 50 µl råsæd med 250 µl formolcitrat. Indholdet i formolcitraten fremgår af tabel 2. Selve fikseringen blev foretaget ved at overføre en dråbe af blandingen til et objektglas, som derefter blev forsynet med et dækglas. Vurderingen af præparatet udførtes ved at undersøge akrosomalkappen på minimum 100 sædceller ved 1.000 ganges forstørrelse (olieimmersion). Vurderingen af akrosomalkappen blev udført ad modum Pursel et al. (1972) (2). De morfologiske fund på akrosomalkappen opdeles i intakt apikal rand og andre. Sidstnævnte defineres som ødelagt apikal rand, manglende apikal rand og løs akrosomalkappe. Sædceller, som ikke kunne karakteriseres som værende med normal eller unormal akrosomalkappe, blev defineret som intermediære. Resultatet blev opgjort som procent sædceller med intakt apikal rand (PIA).

Undersøgelser for intakt akrosomalkappe på færdigfortyndet sæd blev udført ved at blande 125 µl sæd med 250 µl formolcitrat. Det videre forløb er tilsvarende som beskrevet for råsæd.

Figur 1. Undersøgelsesprogram af sædcellernes bevægelighed og procent sædceller med intakt akrosomalkappe herover tid

Tabel 2. Indholdsstoffer i formolcitrat anvendt til undersøgelser af sædcellernes akrosomalkappe

Indholdsstoffer	Mængde	Leverandør
Trinatriumcitratdihydrat Formalin 10 %Destilleret vand	2,9 gram14,0 mlad 1.000 ml	Apoteket ved KVL

Besætningsafprøvning

Afprøvningen blev gennemført med sæd fra Hatting-KS, Horsens afdelingen, leveret til otte produktionsbesætninger i perioden april 1998 - juni 2000.

Kvalitetsgodkendt blandingssæd fra 5-10 Durocorner blev delt i to og fortyndet i EDTA-fortynder indeholdende EU-cocktailen (kontrol) eller en antibiotikakombination bestående af Gentamycin og Amoxicillin. Gruppe, antibiotikum, koncentration og leverandør fremgår af tabel 3.

Tabel 3. Besætningsafprøvning. Gruppe, antibiotika og koncentration i færdigfortyndet sæd

Gruppe	Antibiotika	Koncentration	Leverandør
EU-cocktailen (kontrol)	Streptomycin/Penicillin Lincomycin/Spectinomycin	500 i.e./ml 500 i.e./ml 150 µg/ml 300 µg/ml	Medicinkemi Uldum (MEKU A/S)
Ny antibiotika- kombination (forsøg)	Amoxicillin/Gentamycin	100 µg/ml 100 µg/ml	SmithKline BeechamSigma

Sæddoserne blev mærket med en kode for gruppenummer for at blinde forsøget overfor besætningsejerne og udsendtes som en fast leverance hver mandag til besætningerne. Den udsendte sæd skulle anvendes samme og efterfølgende dag, for at de inseminerede søer kunne indgå i forsøget.

I besætningerne blev insemineringerne foretaget som renløbninger. Det vil sige, at de to insemineringer per so blev foretaget med sæd med samme kode. Alene søer, som blev insemineret to gange med ca. 24 timer mellem 1. og 2. insemination, indgik i afprøvningen. Der indgik ikke omløbere i afprøvningen. Dersom gylte indgik i afprøvningen tilstræbtes det, at det samme antal gylte indgik i hver af grupperne.

Resultat og diskussion

Bakteriologi, drabseffekt og resistens

Udfra den internationale litteratur samt konkrete bakteriefund fra sæd og svaberprøver fra forhuden af danske orne blev undersøgt et udsnit af bakterier, som ville kunne tænkes at forekomme i sæden. De undersøgte bakteriearter er angivet i tabel 4.

Tabel 4. Den mulige bakterielle population som kan isoleres i sæd fra danske orner

Proteus mirabilis

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

Corynebacterium spp.

Serratia liquefaciens

Providencia stuartii

Providencia spp.

Enterobacter sakazakii

Enterobacter aerogenes

De fundne bakteriearter blev herefter rendyrket og bestemt efter stamme, hvorefter de enkelte bakteriestammer blev undersøgt overfor EU-cocktailen, Amoxicillin og Gentamycin. Sidstnævnte to antibiotika blev anvendt både hver for sig og i kombination. I undersøgelsen blev Salmonella typhimurium, DT104, også inkluderet, selvom denne ikke var fundet som mulig tilstedeværende i sæden. Undersøgelsen inkluderede udover en bestemmelse af den enkelte bakteriestammes resistens også en måling af effekten af antibiotika på de enkelte bakterier dvs., drab eller ikke-drab. Resistensmønsteret er angivet i tabel 5 og 6, mens drabseffekten er angivet i figur 2.

Tabel 5. Resistensmønster for bakteriestammer, som mulige fund i ornesæd, samt Salmonella typhimurium overfor en kombination af Streptomycin, Penicillin, Lincomycin og Spectinomycin (EU-cocktailen)

Bakterieart	Stamme	Følsomhed (F: følsom, I: middel følsom og R: resistent)
Proteus mirabilis	17-1307	I
Proteus mirabilis	17-1310	F
Proteus mirabilis	27-2146	I
Escherichia coli	17-1346	F
Escherichia coli	27-2116	F
Escherichia coli	27-2125	F
Klebsiella pneumoniae	17-1347	R
Klebsiella pneumoniae	27-2178	I
Corynebacterium spp.	17-1354	F
Serratia liquefaciens	14-1132	F
Providencia stuartii	27-2144	F
Providencia spp.	27-2179	F
Enterobacter aerogenes	27-2148	I
Enterobacter sakazakii	27-2177	F
Pseudomonas aeruginosa	27-2127	F
Pseudomonas aeruginosa	27-2143	F
Salmonella typhimurium, DT104	28-2223	R

Tabel 6. Resistensmønster for bakteriestammer, som mulige fund i ornesæd, samt Salmonella typhimurium overfor Gentamycin og Amoxicillin alene og i kombination

Bakterieart

Stamme

Følsomhed (F: følsom , I: middel følsom og R: resistent)

Gentamycin

Amoxicillin

Gentamyin /Amoxicillin

Proteus mirabilis

17-1307

F

F

F

Proteus mirabilis

17-1310

F

R

F

Proteus mirabilis

27-2146

F

F

F

Escherichia coli

17-1346

F

R

F

Escherichia coli

27-2116

F

R

F

Escherichia coli

27-2125

F

F

F

Klebsiella pneumoniae

17-1347

F

R

F

Klebsiella pneumoniae

27-2178

F

R

F

Corynebacterium spp.

17-1354

F

R

F

Serratia liquefaciens

14-1132

F

R

F

Providencia stuartii

27-2144

F

F

F

Providencia spp.

27-2179

F

I

F

Enterobacter aerogenes

27-2148

F

R

F

Enterobacter sakazakii

27-2177

F

F

F

Pseudomonas aeruginosa

27-2127

F

R

F

Pseudomonas aeruginosa

27-2143

F

R

F

Salmonella typhimurium, DT104

28-2223

F

R

F

Som det ses af tabel 5 var 11 ud af 17 bakteriestammer følsomme overfor EU-cocktailen, mens seks bakteriestammer var resistente i mere eller mindre udtalt grad. Ved anvendelse af Gentamycin og Amoxicillin i kombination (tabel 6) var samtlige undersøgte stammer følsomme, inklusiv Salmonella typhimurium, DT104. De samme forhold gjorde sig gældende ved bakteriedrabsforsøget vist i figur 2.

1) En stamme viste afvigende effekt ved brug af EU-cocktailen

2) Indeholder data fra både Serratia og Providencia

Figur 2. Bakteriedrabseffekt af EU-cocktailen og en kombination af Gentamycin og Amoxicillin på bakteriestammer som mulige fund i ornesæd, samt Salmonella typhimurium, DT104

Årsagen til den bedre effekt af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin i forhold til EU-cocktailen skal findes i stoffernes virkemåde overfor bakterierne.

Gentamycinsulfat, tilhører gruppen af aminoglykosider, og er en blanding af tre tæt relaterede antibakterielle stoffer. Gentamycin virker via hæmning af et bakterielt protein inde i bakterien, som bevirker, at bakterien ikke kan dele sig. Gentamycin er aktiv overfor Enterobacter aerogenes, E. coli og Klebsiella pneumoniae, indol-positive og indol-negative arter af Proteus og Pseudomonas aeruginosa, Serratia og mange arter af Salmonella og Shigella. Endvidere virker stoffet overfor Vibrio coli og Brachyspira hyodysenteria.

Amoxicillin (alfa-amino-p-hydroxy-benzyl-penicillin) virker bakteriedræbende ved at destabilisere bakteriernes kappe. Amoxicillin er aktiv overfor de samme bakterier som Penicillin G samtidig med effekt på gram-negative bakterier herunder mange entero-patogene arter.

De to stoffer har i kombination en synergistisk effekt, hvilket vil sige, at de virker mere effektivt sammen end alene, hvorved risikoen for resistens minimeres.

Hverken Gentamycin eller Amoxicillin har med sikkerhed vist effekt overfor Mykoplasma eller Leptospirer. En effekt overfor disse to bakterier kræves ved salg af sæd udenfor Danmarks grænser i henhold til ”Veterinærdirektoratets bekendtgørelse om ornesæd nr. 598 af 29. juni 1992”. En anvendelse af antibiotikakombinationen er derfor alene tænkt til anvendelse i sæd til salg i Danmark.

Dog skal det nævnes, at Mykoplasma i sæd aldrig er bevist som værende årsag til smitte via kunstig sædoverføring (3).

Bevægeligheds- og akrosomalkappe-undersøgelser

Undersøgelser for bevægelighed blev udført 24, 72 og 96 timer efter opsamling og sammenlignet med bevægeligheden ved opsamling. Data er derfor udtrykt som et fald i bevægelighed henover tid for samme ejakulat fortyndet i EDTA-fortynderen med EU-cocktail, Neomycinsulfat og en kombination af Gentamycin og Amoxicillin. Gennemsnitsfald i bevægelighed samt standardafvigelse er vist i tabel 7, mens resultater fra de enkelte ejakulater er vist i appendiks 1.

Tabel 7. Gennemsnitsfald i procent og standardafvigelse i bevægelighed 0-24, 0-72 og 0-96 timer efter opsamling

Gruppe	Gennemsnitsfald (standardafvigelse) henover tiden (antal prøver per gruppe/tidsinterval = 100)
	0 - 24 timer	0 - 72 timer	0 - 96 timer
EU-cocktail(Kontrol 1)	24,0 (28,9)	44,8 (33,2)	60,8 (28,6)
Neomycin(Kontrol 2)	24,4 (26,1)	46,0 (31,4)	59,6 (29,0)
Gentamycin/Amoxicillin(Forsøg)	24,0 (26,7)	47,3 (31,4)	61,4 (27,8)

Tabel 7 skal læses som, jo mindre talværdi, jo mindre fald, og dermed jo bedre bevægelighed. Sammenlignes tallene lodret indenfor de enkelte tidsintervaller ses det, at der ikke er forskel mellem forsøgsgruppen og de to kontrolgrupper. Dette betyder, at en kombination af Gentamycin og Amoxicillin ikke hæmmer bevægeligheden af sædceller sammenlignet med anvendelse af EU-cocktailen eller Neomycin.

I appendiks 1 er enkelte værdier for faldet i bevægelighed angivet som negative tal, hvilket vil sige, at tallet for bevægelighed er blevet vurderet højere efter 24, 72 eller 96 timer end ved opsamling. Dette fænomen er sjældent realistisk, men alene et udtryk for, at metoden til bevægelighedsundersøgelse er delvis subjektiv.

Undersøgelse for intakt sædcelle akrosomalkappe blev udført 72 timer efter opsamling og sammenlignet med en bedømmelse ved opsamling. Resultatet er udtrykt som et fald i intakt akrosomalkappe henover tid for samme ejakulat fortyndet i EDTA-fortynderen med EU-cocktail, Neomycinsulfat og en kombination af Gentamycin og Amoxicillin. Gennemsnitsfald i procent sædceller med intakt akrosomalkappe, samt standardafvigelse er vist i tabel 8, mens resultater fra de enkelte ejakulater er vist i appendiks 2.

Tabel 8 skal læses, som jo mindre talværdi, jo mindre fald, og dermed en højere procentdel sædceller med intakt akrosomalkappe i tidsintervallet 0-72 timer. Der ses ikke forskel mellem forsøgsgruppen og de to kontrolgrupper. Dette betyder, at en kombination af Gentamycin og Amoxicillin ikke udviser større akrosomalkappeskadende effekt end EU-cocktailen eller Neomycin.

Tabel 8. Gennemsnitsfald og standardafvigelse i procent sædceller med intakt, akrosomalkappe 0-72 efter opsamling

Gruppe		Gennemsnitsfald (standardafvigelse) henover tiden (antal prøver per gruppe/tidsinterval 10exp5)
		0 - 72 timer
EU-cocktail(Kontrol 1)		9,2 (6,4)
Neomycin(Kontrol 2)		9,5 (6,0)
Gentamycin/Amoxicillin(Forsøg)		9,2 (6,0)

Besætningsafprøvning

Tabel 9 viser faringsprocent og totalfødte grise per kuld som et gennemsnit for de otte involverede besætninger. Data for de enkelte besætninger kunne adderes, da en statistisk analyse viste, at der ikke var en vekselvirkning mellem besætninger. Faringsprocent og totalfødte grise per kuld for den enkelte besætning er angivet i appendiks 3.

Tabel 9. Antal søer i forsøg, gennemsnit af faringsprocent og totalfødte grise per kuld samt standardafvigelser for 8 besætninger

Gruppe	Antal søer i forsøg	Faringsprocent (standardafvi-gelse)	Antal kuld i forsøg	Totalfødte grise per kuld (standardafvigelse)
EU-cocktail (Kontrol)	1.639	86,40 (35,24)	1.403	12,87 (3,16)
Gentamycin/Amoxicillin (Forsøg)	1.634	86,57 (35,10)	1.399	12,86 (3,10)

Forsøget var planlagt til at omfatte 1.400 kuld per gruppe. Med denne kuldstørrelse vil det være muligt at kunne påvise en forskel i faringsprocent på 2,41, samt en forskel i totalfødte grise per kuld på 0,24 ved en spredning på kuldstørrelsen på 3,2. Tabel 9 viser, at forsøgsgruppen ikke giver en statistisk sikker forskel i faringsprocent eller totalfødte grise per kuld sammenlignet med kontrolgruppen. Det betyder, at kombinationen af Gentamycin og Amoxicillin ikke påvirker faringsprocent eller totalfødte grise per kuld negativt, når der sammenlignes med EU-cocktailen. Endvidere viser data, at gylte indgår med en ligelig fordeling inden for hver gruppe og hver besætning.

Der blev ikke under hele forsøgsperioden i de otte besætninger berettet om negativ effekt (”adverse effect”) ved anvendelse af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin i EDTA-fortynderen som tilsætning til ornesæd.

Konklusion

Anvendelse af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin som tilsætning til ornesæd i EDTA-fortynder, har vist sig effektiv overfor mulige forekommende bakterier isoleret fra ornesæd, samt fra ornens forhud. Herudover har antibiotikakombinationen vist sig effektiv overfor Salmonella typhimurium, DT104. Antibiotikakombinationen er ikke med sikkerhed effektiv overfor Mykoplasma eller Leptospirer, som kræves af myndighederne ved salg af sæd uden for Danmark.

En undersøgelse af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin på sædcellebevægelighed 24, 72 og 96 timer efter opsamling, samt en undersøgelse for sædskadende effekt udtrykt som beskadigelse af akrosomalkappen på sædcellerne 72 timer efter opsamling, har ikke vist en forskel ved sammenligning med den pt. anvendte EU-cocktail eller den tidligere anvendte Neomycinsulfat.

I en besætningsafprøvning med otte besætninger og ca. 1.400 kuld per gruppe blev en kombination af Gentamycin og Amoxicillin afprøvet overfor EU-cocktailen. Der fandtes ingen statistisk sikker forskel i faringsprocent eller totalfødte grise per kuld. Endvidere blev der ikke berettet om negativ effekt (”adverse effect”) ved anvendelse af en kombination af Gentamycin og Amoxicillin i EDTA-fortynderen.

Da Gentamycin og Amoxicillin har synergistisk effekt, dvs., at de i kombination virker mere effektivt end alene, betyder en anvendelse af disse to stoffer samtidigt en minimering af risikoen for udvikling af resistens mod et eller begge stoffer.

Det kan konkluderes, at en kombination af Gentamycin og Amoxicillin anvendt i EDTA-fortynderen til fortynding af ornesæd forhindrer overførsel af mulige forekomne bakterier inklusiv Salmonella typhimurium, DT104. Endvidere ses en neutral effekt på sædcellernes bevægelighed, akrosomalkappe, samt reproduktionsresultater udtrykt som faringsprocent og totalfødte grise per kuld.

Det må derfor anbefales at anvende en kombination af Gentamycin og Amoxicillin som tilsætning til ornesæd i stedet for den pt. anvendte EU-cocktail eller den tidligere anvendte Neomycinsulfat. Anbefalingen gælder alene salg af sæd i Danmark, da en kombination af Gentamycin og Amoxicillin ikke med sikkerhed virker overfor Mykoplasma eller Leptospirer, som krævet af myndighederne ved salg af sæd uden for landets grænser.

Der er ansøgt om tilladelse til anvendelse af den nye antibiotikakombination, men tilladelse er endnu ikke givet af Fødevaredirektoratet.

Referencer

1.	”Regler for drift og smittebeskyttelse på KS-stationer” (udg. oktober 1997)”, Landsudvalget for Svin
2.	“Acrosome morphology of boar spermatozoa incubated before cold stock”, V. G. Purcel. et al. (1972), J. Anim. Sci., 34, 278
3.	”Mykoplasma i ornesæd”, K. Eriksen (1998), Litteraturstudie, Landudvalget for Svin

Afprøvningen er udført i samarbejde med:

Fagdyrlæge vedrørende svin, Lisbeth Vesterager Borge

Landbrugstekniker Hanne Nissen, Landsudvalget for Svin.

Laboratorieleder Susanne Christensen, Hatting-KS, Horsens afdelingen

Laboratorietekniker Hanne Erez, Hatting-KS, Ringsted afdelingen

Appendiks 1 - Enkeltdata fra bevægelighedsundersøgelsen

Motilitetsundersøgelse: I = EU-cocktail, II= neomycin og III = gentamycin/amoxicillin I = EU-cocktail, II = Neomycinsulfat og III = Gentamycin/Amoxicillin

Orne	T 0	------- I -------				------- II -------				------- III -------				Fald T 0 - 24					Fald T 0 - 72					Fald T 0 - 96
nr.		T 24	T 72	T 96		T 24	T 72	T 96		T 24	T 72	T 96		I	II	III			I		II	III			I	II		III
7499	90	90	30	IB		70	10	IB		90	40	IB		0	20	0			60		80	50			IB	IB		IB
7497	90	20	10	IB		70	50	IB		80	30	IB		70	20	10			80		40	60			IB	IB		IB
3430	90	90	50	IB		90	50	IB		80	40	IB		0	0	10			40		40	50			IB	IB		IB
8754	90	90	80	80		90	60	40		90	70	40		0	0	0			10		30	20			10	50		50
8756	90	90	90	80		90	80	70		90	90	80		0	0	0			0		10	0			10	20		10
8752	90	90	80	70		90	70	50		90	70	50		0	0	0			10		20	20			20	40		40
5688	90	90	80	70		80	70	70		90	60	60		0	10	0			10		20	30			20	20		30
7593	90	80	80	50		80	50	10		90	40	20		10	10	0			10		40	50			40	80		70
5686	90	90	50	50		90	40	20		50	60	10		0	0	40			40		50	30			40	70		80
3660	40	*Råsædsdosis kunne ikke bestemmes på grund af motilitet 40													40		40			40	40	40			40	40	40
5272	70	90	90	50		90	80	50		90	70	50		-20	-20	-20			-20		-10	0			20	20		20
8747	90	90	80	80		80	80	60		90	80	80		0	10	0			10		10	10			10	30		10
8017	90	90	80	80		90	70	70		90	60	60		0	0	0			10		20	30			10	20		30
8018	90	80	80	80		60	80	70		80	70	70		10	30	10			10		10	20			10	20		20
7303	90	90	50	50		80	50	50		90	50	50		0	10	0			40		40	40			40	40		40
3806	90	80	60	30		80	40	30		70	10	10		10	10	20			30		50	80			60	60		80
8020	90	90	70	50		80	60	50		70	70	50		0	10	20			20		30	20			40	40		40
5225	90	80	80	60		80	70	70		80	70	70		10	10	10			10		20	20			30	20		20
3705	90	70	80	10		70	60	20		70	20	20		20	20	20			10		30	70			80	70		70
3555	80	80	30	5		80	30	30		80	50	50		0	0	0			50		50	30			75	50		30
7495	80	70	70	30		60	60	50		70	50	50		10	20	10			10		20	30			50	30		30
7496	90	80	80	60		80	80	70		50	50	40		10	10	40			10		10	40			30	20		50
7299	90	90	90	70		80	80	70		70	50	50		0	10	20			0		10	40			20	20		40
5184	90	60	60	20		60	60	30		50	40	20		30	30	40			30		30	50			70	60		70
5892	90	50	10	0		50	10	0		50	0	0		40	40	40			80		80	90			90	90		90
5881	90	20	0	0		20	10	0		20	10	0		70	70	70			90		80	80			90	90		90
8749	90	70	10	0		50	0	0		80	10	0		20	40	10			80		90	80			90	90		90
8092	90	60	60	10		80	40	10		80	30	10		30	10	10			30		50	60			80	80		80
5890	90	70	70	60		60	60	60		50	50	50		20	30	40			20		30	40			30	30		40
8758	80	70	0	0		50	0	0		30	0	0		10	30	50			80		80	80			80	80		80
8093	90	60	40	40		60	40	10		80	20	10		30	30	10			50		50	70			50	80		80
8090	90	90	90	60		90	80	60		80	80	10		0	0	10			0		10	10			30	30		80
8756	80	70	20	0		70	20	0		80	10	0		10	10	0			60		60	70			80	80		80
5895	90	80	80	70		60	70	50		60	60	50		10	30	30			10		20	30			20	40		40
886	90	90	90	40		90	90	80		90	90	40		0	0	0			0		0	0			50	10		50
5889	90	70	70	0		80	60	0		70	70	0		20	10	20			20		30	20			90	90		90
5885	90	60	60	10		60	50	20		40	60	40		30	30	50			30		40	30			80	70		50
5894	90	50	50	30		40	40	10		30	50	30		40	50	60			40		50	40			60	80		60
943	90	90	60	40		90	90	50		90	90	50		0	0	0			30		0	0			50	40		40
5694	90	90	90	80		90	80	80		90	80	80		0	0	0			0		10	10			10	10		10
5690	90	70	60	60		80	80	70		80	80	70		20	10	10			30		10	10			30	20		20
5883	80	40	80	0		40	60	10		40	60	20		40	40	40			0		20	20			80	70		60
5765	90	70	40	0		70	10	10		60	10	10		20	20	30			50		80	80			90	80		80
5760	80	90	70	20		90	70	50		90	80	70		-10	-10	-10			10		10	0			60	30		10
5764	90	90	70	70		90	80	80		90	80	80		0	0	0			20		10	10			20	10		10
7309	90	90	60	60		90	80	80		90	60	60		0	0	0			30		10	30			30	10		30
2082	80	80	70	70		80	80	80		80	80	80		0	0	0			10		0	0			10	0		0
5860	90	90	50	50		90	70	70		90	80	70		0	0	0			40		20	10			40	20		20
5854	90	80	40	20		90	70	50		90	70	30		10	0	0			50		20	20			70	40		60
5773	80	70	50	30		80	80	70		80	50	40		10	0	0			30		0	30			50	10		40
7301	80	70	10	10		70	10	10		70	30	30		10	10	10			70		70	50			70	70		50
7303	80	80	30	10		50	20	10		70	70	60		0	30	10			50		60	10			70	70		20
5284	90	80	50	10		80	50	20		80	50	20		10	10	10			40		40	40			80	70		70
7301	80	80	10	0		80	50	10		80	70	10		0	0	0			70		30	10			80	70		70
7302	90	90	80	70		90	80	70		90	80	70		0	0	0			10		10	10			20	20		20
5721	90	90	80	70		80	70	70		80	70	60		0	10	10			10		20	20			20	20		30
5757	70	70	70	30		70	60	10		70	70	0		0	0	0			0		10	0			40	60		70
5760	90	70	70	70		80	70	60		70	70	50		20	10	20			20		20	20			20	30		40
5763	70	60	60	10		60	50	10		60	50	10		10	10	10			10		20	20			60	60		60
5764	90	90	80	80		90	80	80		90	80	80		0	0	0			10		10	10			10	10		10
5762	90	80	70	20		80	40	10		80	60	10		10	10	10			20		50	30			70	80		80
3430	90	90	90	60		90	80	60		80	80	20		0	0	10			0		10	10			30	30		70
3846	90	80	70	5		80	80	10		80	70	0		10	10	10			20		10	20			85	80		90
5775	90	70	50	0		70	50	0		50	50	0		20	20	40			40		40	40			90	90		90
5773	90	70	10	0		50	20	5		70	10	5		20	40	20			80		70	80			90	85		85
7575	90	80	50	0		80	50	0		70	50	0		10	10	20			40		40	40			90	90		90
5774	90	90	10	0		80	10	0		90	10	5		0	10	0			80		80	80			90	90		85
7499	80	70	70	0		70	70	0		50	50	0		10	10	30			10		10	30			80	80		80
7295	90	70	60	0		50	50	0		50	50	0		20	40	40			30		40	40			90	90		90
5886	80	70	70	0		70	50	10		80	70	0		10	10	0			10		30	10			80	70		80
7479	90	10	5	0		30	20	0		40	20	0		80	60	50			85		70	70			90	90		90
7598	80	20	0	0		20	0	0		20	0	0		60	60	60			80		80	80			80	80		80
7496	70	10	10	0		30	30	0		30	30	0		60	40	40			60		40	40			70	70		70
3709	90	10	0	20		20	5	40		20	0	30		80	70	70			90		85	90			70	50		60
5892	80	10	0	0		10	0	0		20	0	0		70	70	60			80		80	80			80	80		80
5879	90	70	0	0		70	0	0		70	0	0		20	20	20			90		90	90			90	90		90
5891	90	70	0	20		60	0	5		50	0	5		20	30	40			90		90	90			70	85		85
5773	80	30	0	0		10	0	5		30	0	5		50	70	50			80		80	80			80	75		75
2054	90	80	5	0		80	0	0		80	5	0		10	10	10			85		90	85			90	90		90
5854	90	80	0	0		70	5	0		70	0	0		10	20	20			90		85	90			90	90		90
5889	80	50	0	0		20	0	0		30	0	0		30	60	50			80		80	80			80	80		80
5762	80	40	0	0		40	5	0		50	5	0		40	40	30			80		75	75			80	80		80
5760	90	70	0	5		70	0	10		70	0	10		20	20	20			90		90	90			85	80		80
5878	70	60	0	0		60	10	5		60	10	10		10	10	10			70		60	60			70	65		60
5885	90	70	0	0		50	0	0		60	5	5		20	40	30			90		90	85			90	90		85
6518	80	0	0	0		5	0	0		70	0	0		80	75	10			80		80	80			80	80		80
6569	90	5	0	0		10	0	0		10	0	0		85	80	80			90		90	90			90	90		90
6177	90	0	0	0		5	0	0		30	0	0		90	85	60			90		90	90			90	90		90
6498	90	70	30	5		80	40	10		70	10	0		20	10	20			60		50	80			85	80		90
6173	90	10	0	0		40	0	0		0	0	0		80	50	90			90		90	90			90	90		90
5721	70	70	0	0		50	0	0		20	0	0		0	20	50			70		70	70			70	70		70
6626	90	30	85	85		80	90	90		70	90	90		60	10	20			5		0	0			5	0		0
2187	90	0	0	0		5	0	0		5	0	0		90	85	85			90		90	90			90	90		90
5756	90	5	0	0		5	0	0		10	0	0		85	85	80			90		90	90			90	90		90
5763	70	20	0	0		10	0	0		5	0	0		50	60	65			70		70	70			70	70		70
6165	80	50	5	0		70	5	0		70	0	0		30	10	10			75		75	80			80	80		80
6147	90	20	0	0		40	0	0		30	0	0		70	50	60			90		90	90			90	90		90
5765	90	10	0	0		50	0	0		10	0	0		80	40	80			90		90	90			90	90		90
6176	90	5	5	0		5	0	0		5	5	0		85	85	85			85		90	85			90	90		90
2186	90	10	0	0		10	0	0		5	0	0		80	80	85			90		90	90			90	90		90
2058	90	0	0	0		0	0	0		0	0	0		90	90	90			90		90	90			90	90		90
Gns.	86,14	62,65	41,75	25,52	Gns.	62,35	40,50	26,70	Gns.	61,80	39,20	24,90	Fald	23,95	24,41	24,95		Fald	44,80		46,04	47,33	Fald		60,77	59,59		61,38
SD	7,61	29,11	33,92	29,87	SD	26,72	31,91	29,90	SD	27,00	31,56	28,23	SD	28,94	26,13	26,69		SD	33,18		31,36	31,37	SD		28,62	28,97		27,76
Min.	40	0	0	0	Min.	0	0	0	Min.	0	0	0	Min.	-20	-20	-20		Min.	-20		-10	0	Min.		5	0		0
Max.	90	90	90	85	Max.	90	90	90	Max.	90	90	90	Max.	90	90	90		Max.	90		90	90	Max.		90	90		90

Appendiks 2 - Enkeltdata fra akrosomalkappeundersøgelse

Akrosomalbedømmelse: I = EU-cocktail, II = Neomycinsulfat og III = gentamycin/amoxicillin og III = Gentamycin/Amoxicillin

N=105	T 0	------ T 72 ------				------ Fald ------
Orne nr		I	II	III		I	II	III
7499	96	82	81	80		14	15	16
7497	97	81	80	84		16	17	13
3430	96	80	82	81		16	14	15
8754	94	81	83	81		13	11	13
8756	93	80	83	81		13	10	12
8752	96	79	80	79		17	16	17
5688	79	70	68	70		9	11	9
7593	96	82	83	82		14	13	14
5686	95	81	80	82		14	15	13
3860	*Råsæddosis kunne ikke bestemmes, da motilitet 40
5272	93	84	83	82		9	10	11
8747	96	81	79	81		15	17	15
8017	97	80	80	80		17	17	17
8018	96	81	80	82		15	16	14
7303	96	80	82	84		16	14	12
3806	94	82	80	82		12	14	12
8020	94	78	82	82		16	12	12
5225	95	80	82	80		15	13	15
3705	93	86	84	86		7	9	7
3555	93	80	80	80		13	13	13
7495	96	84	84	83		12	12	13
7496	93	82	82	82		11	11	11
7299	96	84	82	82		12	14	14
5184	95	82	84	81		13	11	14
5892	91	84	80	82		7	11	9
5881	89	72	82	80		17	7	9
8749	87	85	84	82		2	3	5
8092	87	70	69	74		17	18	13
5890	94	82	86	87		12	8	7
8758	82	80	80	80		2	2	2
8093	94	89	90	87		5	4	7
8090	92	90	90	90		2	2	2
8756	86	84	82	80		2	4	6
5895	94	82	80	79		12	14	15
886	93	85	84	85		8	9	8
5889	94	89	70	88		5	24	6
5885	96	84	84	84		12	12	12
5894	94	82	81	80		12	13	14
943	94	80	81	80		14	13	14
5694	96	83	83	85		13	13	11
5690	90	80	80	78		10	10	12
5883	89	80	79	80		9	10	9
5765	94	89	90	87		5	4	7
5760	95	81	82	81		14	13	14
5764	96	70	71	70		26	25	26
7309	94	84	80	82		10	14	12
2082	90	80	80	80		10	10	10
5860	95	79	84	70		16	11	25
5854	96	86	85	86		10	11	10
5773	94	80	80	80		14	14	14
7301	95	70	80	81		25	15	14
7303	90	70	71	70		20	19	20
5284	90	82	81	80		8	9	10
7301	94	89	90	88		5	4	6
7302	92	87	87	87		5	5	5
5721	94	89	89	88		5	5	6
5757	92	88	88	90		4	4	2
5760	96	90	92	90		6	4	6
5763	89	86	87	88		3	2	1
5764	95	84	84	84		11	11	11
5762	94	92	92	91		2	2	3
3430	96	90	92	93		6	4	3
3846	89	84	82	86		5	7	3
5775	96	92	91	90		4	5	6
5773	94	94	91	92		0	3	2
7575	95	89	90	93		6	5	2
5774	92	90	91	90		2	1	2
7499	90	87	86	88		3	4	2
7795	97	92	90	91		5	7	6
5886	97	89	88	91		8	9	6
7479	99	80	81	79		19	18	20
7598	97	94	93	94		3	4	3
7496	94	87	80	86		7	14	8
3709	99	86	84	86		13	15	13
5892	96	90	89	90		6	7	6
5879	98	94	94	94		4	4	4
5891	94	85	83	82		9	11	12
5773	93	83	80	81		10	13	12
2054	94	80	81	83		14	13	11
5854	96	95	96	95		1	0	1
5889	93	93	92	93		0	1	0
5762	96	92	90	91		4	6	5
5760	96	93	93	93		3	3	3
5878	94	92	94	92		2	0	2
5885	94	93	90	93		1	4	1
6518	96	89	88	87		7	8	9
6569	89	84	84	84		5	5	5
6177	91	70	74	69		21	17	22
6498	94	90	90	91		4	4	3
6173	94	89	86	82		5	8	12
5721	90	88	88	90		2	2	0
6626	94	90	90	90		4	4	4
2187	96	89	87	90		7	9	6
5756	94	92	89	92		2	5	2
5763	90	85	84	85		5	6	5
6165	94	70	72	69		24	22	25
6147	92	91	90	90		1	2	2
5765	94	89	89	89		5	5	5
6176	92	90	91	90		2	1	2
2186	89	87	87	87		2	2	2
2058	92	60	62	70		32	30	22
Middeltal	93,46	84,14	83,94	84,22	Middeltal	9,32	9,52	9,24
SD	3,22	6,54	6,14	6,12	SD	6,39	5,96	6,00
Min.	79	60	62	69	Min.	0	0	0
Max.	99	95	96	95	Max.	32	30	26

Appendiks 3 - Besætningsdata fra besætningsafprøvningen

Besætningsnr.

Gruppe

Antal søer

Faringspct. (SD*)

Antal kuld

Totalfødte grise/kuld (SD*)

11

1

2

257

258

84,44 (36,32)

83,72 (36,99)

218

216

12,58 (3,24)

12,65 (2,99)

108

1

2

181

176

93,92 (23,96)

91,48 (28,00)

170

161

12,53 (3,10)

12,79 (3,07)

632

1

2

232

216

81,90 (38,59)

81,02 (39,31)

190

175

12,58 (2,93)

12,67 (3,33)

633

1

2

228

223

82,89 (37,74)

85,20 (35,59)

190

190

13,00 (3,47)

12,69 (3,54)

634

1

2

182

190

89,56 (30,66)

82,63 (37,98)

163

157

13,23 (3,02)

12,54 (2,68)

635

1

2

179

184

81,01 (39,34)

84,24 36,54)

145

155

12,93 (3,59)

12,98 (2,77)

636

1

2

197

193

93,91 (23,98)

94,30 (23,24)

185

182

14,03 (2,65)

14,53 (2,74)

637

1

2

185

195

76,76 (42,35)

83,59 (37,13)

142

163

12,82 (2,96)

12,51 (3,05)

Gruppe 1 = Færdigfortyndet sæd med EU-cocktailen

Gruppe 2 = Færdigfortyndet sæd med Gentamycin og Amoxicillin

* Standardafvigelse