Resultaterne viser, at det har stor indflydelse, hvilket fortyndingsmedie der vælges. Det anvendte danske medie er udmærket, men fotometermetoden er ret usikker til at forudsige sædkoncentrationen.

Koncentrationsbestemmelse af antal sædceller pr. ejakulat hos orner er af stor betydning for udnyttelsen af KS-ornerne. Derfor er den danske metode blevet sammenlignet med metoder anvendt i andre europæiske lande. Der er anvendt samme type måleapparat, men forskellige fortyndingsmedier til selve målingen samt forskellige fortyndingsgrader.

Resultaterne viser, at det har stor indflydelse, hvilket fortyndingsmedie der vælges. Det anvendte danske medie er udmærket, men fotometermetoden er ret usikker til at forudsige sædkoncentrationen.

En computerbaseret metode (CASA) blev desuden sammenlignet med direkte tælling, som er et udtryk for det sande indhold. CASA metoden er betydelig mere usikker end de direkte tællinger på grund af stor spredning på dens tællinger.

Baggrund

På de danske KS-stationer udføres koncentrationsbestemmelsen af ornesæd ved hjælp af fotometre. I fotometret gennemlyses en fortyndet sædprøve med lys med en bølgelængde på 540 nm. Den mængde lys der tilbageholdes (ekstinktionsværdien) hænger sammen med sædens koncentration. Fotometermetoden er imidlertid usikker, idet resultater (se rapport nr. 2) har vist, at der er stor variation i bestemmelsen.

I denne undersøgelse er det derfor blevet undersøgt, om der kan opnås bedre resultater med andre fortyndingsmedier i fotometerkuvetten, fremfor EDTA der er brugt hidtil. I Vesttyskland anvendes natriumcitrat og hancockopløsningen med tilfredsstillende resultat.

Sædcellernes aktivitetsniveau nedsættes med disse fortyndingsmedier inden målingen. For yderligere at undersøge om fortyndingsgraden har betydning for koncentrationsbestemmelse, blev 40 og 25 gange fortynding sammenlignet.

Direkte tællinger i hæmacytometer er udtryk for den sande koncentration, men det er en tidskrævende metode. Derfor blev det desuden undersøgt, om CASA (Computer Assisteret Spermie Analyse) dvs. en tællemetode vha. computer, kunne erstatte denne metode.

Gennemførelse

På KS-stationen Hatting Ringsted blev der til undersøgelsen indsamlet 279 sædprøver fra 93 tilfældigt udvalgte orner fordelt på alle racer. Alle orner indgik i en normal sædopsamlingsrutine.

Fra det nyopsamlede ejakulat blev der udtaget 3 separate sædprøver, og for hver af disse blev 0,5 ml. fortyndet:

40 gange med EDTA (EDTA 40)
25 gange med EDTA (EDTA 25)
40 gange med natriumcitrat (naci 40)
25 gange med natriumcitrat (naci 25)
40 gange med hancockopløsning (hanc 40)
25 gange med hancockopløsning (hanc 25)

Sammensætningen af de anvendte fortyndingsmedier er følgende:

EDTA:	6 pct. glukose, 0,4 pct. natriumcitrat, 0,4 pct. natriumedetat, 0,1 pct. natriumbokarbonat + destilleret vand. EDTA er den fortyndingsvæske, der anvendes rutinemæssigt til opbevaring af ornesæd.
Natriumcitrat:	2,9 pct. natriumcitrat + destilleret vand.
Hancockopløsningen:	0,6 pct. dinatriumphosphat, 0,3 pct. kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 pct. natriumclorid, 13,3 pct. dit. formaldehydi (36 pct.) + destilleret vand.

Hver af de 6 ovenstående fortyndinger blev grundigt blandet, og ekstinktionsværdien blev målt i et fotometer (Corning 252) med 540 nm filter.

Koncentrationsbestemmelsen på hver af de 3 separate sædprøver fra samme ejakulat blev ("den sande værdi") foretaget i et Thoma hæmacytometer (direkte tælling). Dette har to tællekamre med et kendt rumfang, og ved forstørrelse kan antallet af sædceller pr. rumfang tælles. Hvis de to tællekamres spermieantal afveg mere end 10 pct. fra hinanden, blev der foretaget en ny tælling.

Til CASA metoden blev der fremstillet en 6 gange fortyndet sædprøve, der blev overført til et tællekammer. Ved hjælp af mikroskop med videokamera blev der optaget 15 sek. film fire steder i tællekammeret. Antallet af spermier pr. prøve blev beregnet på den computer, som analyserede videobillederne.

De direkte tællinger og CASA blev foretaget samme dag og dagen efter fotometermålingerne.

Måletidspunktet omfattede hver mandag og tirsdag i 14 uger.

Resultater

Måleresultaterne, som stammer fra det første måletidspunkt, er signifikant forskellige fra de øvrige, hvilket formentlig skyldes usikkerhed ved udførsel af målingerne. Disse resultater er derfor blevet udeladt i beregningerne.

Alle måleresultater er transformeret med den naturlige logaritme, hvorved fås en lineær funktion, hvor koncentrationen afhænger lineært af fotometerværdien, og spredningen kan udtrykkes i procent.

Gennemsnittet af de tre gentagne målinger for hvert ejakulat er anvendt i beregningen af spredningen (tabel 1). Det resulterede i, at 93 ejakulater blev undersøgt.

Spredning anvendes i denne rapport, som et udtryk for hvor præcist koncentrationen i et ejakulat kan forudsiges ved hjælp af en fotometerværdi og 3 direkte tællinger.

Tabel 1. Spredningen (pct.) for de enkelte fortyndingsmedier og -grader med forskellige tællemetoder
Tællemetode	EDTA 25	EDTA 40	naci 25	naci 40	hac 25	hanc 40
Direkte tælling¹	13,1	12,9	11,6	11,6	23,6	21,3
CASA¹	44,7	46,2	41,5	42,6	47,5	47,3
¹ Måleresultaterne fra første måletidspunkt er udeladt.

Som det fremgår af tabel 1, varierer spredningen for de direkte tællinger fra 12-23 pct. Variationen på de direkte tællinger i hæmacytometer er fundet til ca. 7 pct. Der blev i gennemsnit talt ca. 60 sædceller pr. tælling.

Der er i beregning af spredningen fundet en signifikant forskel på ornerne. Dette kan forklares som niveauforskydning af de enkelte orners sædkoncentration, dvs. èn fotometerværdi ikke altid svarer til den samme koncentration for de enkelte orner. Denne ornevariation er medvirkende til, at spredningen øges. I spredningen, som er anført i tabellen, er ornernes variation medtaget.

For naci 25 og naci 40 har der endvidere været en effekt af måletidspunktet, hvilket bevirker, at spredningen omkring kurven vil være større end den, der er angivet i tabellen.

Ved brug af CASA-metoden varierer spredningen 41-47 pct. Denne store spredning skyldes sandsynligvis, at der er talt for få celler pr. tælling, bl.a. fordi computeren ikke tæller sædceller, der ligger i klumper.

Diskussion og konklusion

Undersøgelsen har vist, at spredningen på koncentrationsbestemmelsen afhænger af, hvilket fortyndingsmedie der er anvendt.

Hancockopløsningen har den største spredning, hvilket overvejende skyldes udfældninger ved blanding med sæd. Udfældningerne medfører overvurderede ekstinktionsværdier og dermed dårligere koncentrationsbestemmelse.

Natriumcitrat har mindre spredning end EDTA, men på grund af påvirkning fra måletidspunktet er den reelle spredning større.

Koncentrationsbestemmelse med CASA-metoden er mere usikker end med direkte tællinger i tællekammer.

En del af CASA-metodens store spredning kan skyldes, at computeren ikke kan tælle spermier i klumper og flere lag. Derimod er der chance for, at der tælles andre partikler med, hvis de har form og størrelse som spermier. Derfor vil en videreudvikling af CASA-metoden være nødvendig, hvis den skal erstatte de direkte tællinger.

EDTA, der anvendes i dag, er det bedste af de 3 fortyndingsmedier, der har været undersøgt, da det ikke har tendens til at fælde ud ved blanding med sæd. Desuden påvirkes måleresultaterne foretaget med EDTA ikke af måletidspunktet. Uanset hvilket fortyndingsmedie, der er anvendt, har 40 gange fortyndingen haft mindre spredning end 25 gange fortynding.

EDTA med 40 gange fortyndingen vil hermed som helhed være mest nøjagtig til koncentrationsbestemmelse i sæd. Til EDTA 40 kan der fremstilles en fortyndingskurve med følgende ligning.

Sædceller pr. mm³ = 4800 × (fotometerværdi^1,27)

Kurven er vist i figur 1.

Der er ved sammenligning af de enkelte fotometre fundet, at de ikke måler ens værdier for samme prøve. Forskellen mellem fotometrene skyldes sandsynligvis at prøverne er uklare. Den fremstillede fortyndingskurve bør derfor kun anvendes til det fotometer, der er brugt i undersøgelsen. Ved hjælp af en transformering af fortyndingskurven kan den bruges til andre fotometre.

Bestemmelse af koncentrationen i et orneejakulat ved hjælp af fotometre er, som det ses i tabel 1, noget usikker. Ved anvendelse af metoden i praksis vil det forventede indhold på ca. 2,0 mia. sædceller pr. sæddosis for 95 pct. af ejakulaternes vedkommende kunne ligge i intervallet 1,48-2,5 mia. Det er derfor ønskeligt, at der udvikles bedre metoder, som kan bestemme koncentrationen.


Figur 1.	Spermiekoncentrationen pr. mm³ i ornesæd afhængig af fotometerværdi. Hvert punkt angiver gennemsnit af 3 målinger pr. ejakulat

Koncentrationsbestemmelse i ornesæd ved anvendelse af forskellige fortyndingsmedier og -grader