Koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved fotometri

SAMMENDRAG

Der er blevet udarbejdet en ny standardkurve til DS-fotometret, Corning 252, til anvendelse ved koncentrationsbestemmelse af ornesæd. Standardkurven blev udarbejdet på baggrund af fortyndingsrækkeforsøg samt samtidige fotometermålinger og koncentrationsbestemmelser ved tællinger.

To nye typer af fotometre: Shimadzu 1201 og Spectronic 301 blev undersøgt med henblik på fotometrenes egnethed til koncentrationsbestemmelse af ornesæd. Ved koncentrationsbestemmelse med begge de nævnte fotometre var spredningen på bestemmelserne lidt større end ved koncentrationsbestemmelse med Corning 252.

Det kan på baggrund af denne undersøgelse ikke anbefales at udskifte fotometre af typen Corning 252 med Shimadzu 1201 eller Spectronic 301.

Den såkaldte DEFT-analysemetode kan ikke umiddelbart anvendes til koncentrationsbestemmelse af ornesæd.

BAGGRUND

De danske KS-stationer anvender fotometre af typen Corning 252 til koncentrationsbestemmelse af ornesæd.

KS-stationernes fotometre justeres jævnligt ved sammenligning mellem stationsfotometrene og et referencefotometer (DS-fotometer). Standardkurven til DS-fotometret blev udarbejdet i 1990. I januar 1991 blev referencefotometrets standardkurve kontrolleret. Kontrollen viste, at referencefotometrets standardkurve tilsyneladende havde rykket sig.

Corning 252 er et ældre fotometer og der er udviklet nye fotometre med andre og bedre tekniske specifikationer: Digitaliseret aflæsning; måleværdien er et gennemsnit af flere målinger foretaget hurtigt (msek.) efter hinanden; afstanden fra prøven til detektoren er mindre; båndbredden er snævrere d.v.s. at der er mindre variation i bølgelængden af lyset etc. Alle disse tekniske forbedringer forventes at give en mindre spredning på koncentrationsbestemmelsen.

Indenfor levnedsmiddelindustrien er der udviklet et analyseudstyr - DEFT-analyseudstyr - til "koncentrationsbestemmelse" af bakterier, specielt i vandprøver. Metoden er dog for kompliceret og tidskrævende til anvendelse ved koncentrationsbestemmelse af ornesæd på en KS-station. Hvis metoden udviser minimal spredning på koncentrationsbestemmelse af ornesæd, kan metoden derimod bruges til hyppigere kontrol af såvel reference-fotometer som stationsfotometre.

Formålet med undersøgelsen var at udarbejde en ny standardkurve for referencefotometret, at vurdere to nye typer af fotometre samt DEFT-metodens egnethed til koncentrationsbestemmelse af ornesæd.

MATERIALE OG METODE

Undersøgelsen blev gennemført på Hatting Viborg, DS-laboratoriet i Kjellerup og Miljø- og Levnedsmiddelcentret i Horsens.

Igennem fem dage blev der udtaget 10 sædprøver pr. dag d.v.s. ialt 50 prøver. Prøverne blev udtaget således at såvel alle racer som et bredt udsnit af koncentrationer (fotometerværdier fra 0,13-0,68) repræsenteredes.

Der blev fra hver opsamling udtaget to prøver til måling af tæthed i Corning 252, Spectronic 301 og Shimadzu 1201. Hver prøve bestod af 0,5 ml råsæd og 19,5 ml EDTA-fortynder.

Efter aflæsning af fotometerværdierne sammenblandedes de to prøver fra samme ejakulat. Prøverne blev herefter kørt til laboratoriet i Kjellerup til koncentrationsbestemmelse ved tælling. Det var altså nøjagtig de samme prøver, der blev koncentrationsbestemt ved tælling som ved fotometer-måling.

Tællingerne blev udført som dobbelt-bestemmelse. Koncentrationsbestemmelse ved tælling blev foretaget ved at fylde et specielt tællekammer med den fortyndede sædopløsning. Derefter blev tællekammeret anbragt i mikroskop og ved 200 ganges forstørrelse taltes antallet af sædceller i et givent rumfang (0,02 kubik mm). På baggrund af antal sædceller, fortyndingsgrad og rumfang blev koncentrationen i råsæden beregnet.

Fra hvert ejakulat blev der desuden fremstillet to fortyndinger- såkaldte forlag; fortyndingsforholdet afhang af den allerede aflæste fotometerværdi. Forlagene fremstilledes umiddelbart efter opsamling for samtlige de ejakulater, der ønskedes undersøgt den pågældende dag, idet der ved hurtig fortynding opnås en mere homogen blanding.

Ud fra hvert forlag fremstilledes en fortyndingsrække med følgende fortyndingsforhold:

1 ml forlag og 9 ml fortynder

3 ml forlag og 7 ml fortynder

5 ml forlag og 5 ml fortynder

8 ml forlag og 2 ml fortynder

10 ml forlag

Fortyndinsforholdene blev valgt ud fra en antagelse om en lineær sammenhæng d.v.s. at koncentrationen forventedes at være tre gange så stor, når der blev brugt tre gange så meget forlag. Fortyndingsforholdene valgtes desuden for at fotometerudslagene skulle ligge i intervallet 0,15 -0,50 (Corning 252), hvor aflæsningen kan foretages med den største sikkerhed.

Straks efter fortynding blev tætheden i fortyndingerne målt med de tre forskellige fotometre: Corning 252, Spectronic 301 og Shimadzu 1201. Der anvendtes runde optiske genbrugs-cuvetter til Corning og firkantede engangs-cuvetter til Spectronic og Shimadzu.

Ti råsædsprøver á ca. 10 ml sendtes til Miljø- og Levnedsmiddelcentret i Horsens; prøverne anvendtes til koncentrationsbestemmelse ved hjælp af DEFT-analyse-udstyret.

RESULTATER OG DISKUSSION

Analyserne viste, at der var en sammenhæng mellem koncentrationen (bestemt ved tælling) og fotometerudslaget. Ved transformation af værdierne med den naturlige logaritme blev der opnået en lineær sammenhæng.

Sammenhængen kan beskrives ved formlen:

Koncentrationen = a * (fotometerværdi)EXP ^b

hvor a og b er parametre, der angiver henholdsvis skæring og hældning for den rette linie. Hældningen bestemmes bedst ud fra fortyndingsrækkerne, og a estimeres dernæst udfra sammenhørende bestemmelser af fotometerværdien og koncentrationen bestemt ved tælling.

Den gennemsnitlige fotometerværdi i forsøget var for Corning 252 = 0,31 (dobbeltbestemmelse). Dette svarer til en koncentration på 325.000 sædceller pr. kubik mm. Der er en spredning (s) ved denne koncentration på 39.000 sædceller pr. kubik mm.

Den gennemsnitlige fotometerværdi i forsøget var for Shimadzu 1201 = 0,4843 (dobbeltbestemmelse). Dette svarer til en koncentration på 325.000 sædceller pr. kubik mm. Spredningen (s) ved denne koncentration er 45.000 sædceller pr. kubik mm.

Den gennemsnitlige fotometerværdi i forsøget var for Spectronic 301 = 0,4739 (dobbeltbestemmelse). Dette svarer til en koncentration på 325.000 sædceller pr. kubik mm. Spredningen (s) ved denne koncentration er 44.000 sædceller pr. kubik mm.

En sammenligning af de tre fotometre viste, at Corning 252 var mindst lige så velegnet til koncentrationsbestemmelse af ornesæd som Shimadzu 1201 og Spectronic 301, idet spredningen på den fotometerbestemte koncentration var mindre med Corning 252 end med de andre fotometre.

Forventningerne om lavere spredning på målinger foretaget med de nye typer fotometre - på grund af de bedre tekniske specifikationer - blev altså ikke opfyldt.

Tabel 1. Hældninger og estimerede skæringer for de tre anvendte fotometre
	Corning 252	Shimadzu 1201	Spectronic 301
Hældning	0,9814594	0,8842577	0,8956683
Skæring	9,32220	9,25965	9,85723

Tabel 2. Spredningen på koncentrationsbestemmelsen
	Corning 252	Shimadzu 1201	Spectronic 301
Spredning, pct.	12,0	13,9	13,5

Med hensyn til DEFT-analyse-metoden, blev det fra Miljø- og Levnedsmiddelcentret i Horsens oplyst, at det var vanskeligt at filtrere prøverne (filtreringen er nødvendig med henblik på tælling ved DEFT-metoden). Spredningen på målinger indenfor samme prøve var 23 pct.

Usikkerheden på koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved lysabsorption (nævnte fotometre) er forholdsvis stor; i 95 pct. af tilfældene vil den faktiske koncentration i en given prøve således ligge indenfor standardkurve-koncentrationen ±24 pct. (Corning 252).

Det kan, på baggrund af denne undersøgelse, ikke anbefales at udskifte de nuværende KS-stationsfotometre af typen Corning 252 med Shimadzu 1201 eller Spectronic 301, idet usikkerheden på koncentrationsbestemmelse af ornesæd med Shimadzu 1201 og Spectronic 301 var mindst lige så stor som med Corning 252.