Koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved dna-farvning

SAMMENDRAG

I samarbejde med Slagteriernes Forskningsinstitut blev der i perioden maj 1990 til september 1994 udarbejdet en ny metode til koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved DNA-farvning. Princippet i metoden er, at et fluorochrome (farvestof) tilsættes sæden, trænger ind i de enkelte sædceller og går i forbindelse med DNA i sædcellen, hvorved der dannes et fluorescerende kompleks.

I de første undersøgelser anvendtes fluorochromet Hoechst 33258. Undersøgelserne afklarede temperatur og tidsafhængighed, samt om der ved fortyndingsrækker indenfor samme sædopsamling var linearitet mellem fluorescensudslaget og fortyndingsgraden. Dernæst blev det undersøgt, om der var baggrundsstråling fra fortyndingsmediet, farvereagenset eller sædplasmaen. Fluorometermetoden blev i en forundersøgelse vurderet ved samtidig koncentrationsbestemmelse af 15 opsamlinger ved fluorometri, fotometri og ved tælling. Fluorometermetoden viste her mindst lige så god korrelation til koncentrationen bestemt ved tælling som fotometermetoden. Metoden blev justeret efter en tilsvarende hollandsk metode og nye undersøgelser indikerede, at metoden blev mere følsom og at lineariteten blev forbedret.

I den seneste undersøgelse blev der anvendt to fluorochromer: Hoechst 33258 og DAPI til koncentrationsbestemmelse af 50 opsamlinger. Usikkerheden på koncentrationsbestemmelsen ved fluorometri var i denne undersøgelse større end den tilsvarende usikkerhed ved fotometri. På baggrund af disse resultater kan fluorescensmetoden ikke umiddelbart anbefales til koncentrationsbestemmelse af ornesæd.

BAGGRUND

På de danske KS-stationer foretages koncentrationsbestemmelse af ornesæd ved hjælp af et fotometer. Metoden er behæftet med en betydelig usikkerhed. På grund af denne usikkerhed udnyttes den enkelte sædopsamling ikke optimalt, idet der må arbejdes med en sikkerhedsmargin af sædceller til hver sæddose.

Ved fluorescensmetoden tilsættes et specielt farvestof - et fluorochrome - til sæden. Farvestoffet binder sig til DNA'et i sædcellen, hvorved der dannes et kompleks, som afgiver et fluorescerende lys. Den afgivne lysmængde afhænger af mængden af DNA og dermed af antallet af sædceller.

Formålet med undersøgelsen var at udarbejde en standardkurve til fotometret samt en standard kurve til fluorometret med henholdsvis DAPI og Hoechst 33258. Ud fra spredningen på såvel hældningen som skæringen for standardkurven for de tre metoder var det muligt at vurdere metoderne i forhold til hinanden.

MATERIALE OG METODE

I samarbejde med Slagteriernes Forskningsinstitut og KS-stationerne er der foretaget en metodeudvikling jf. delrapporterne 1-8 fra Slagteriernes Forskningsinstitut og DS.

Undersøgelserne blev gennemført på Slagteriernes Forskningsinstitut i perioden fra maj 1990 til september 1994 i samarbejde med Hatting Ringsted. Forundersøgelserne er beskrevet i detaljer i delrapporterne 1-7. Den endelige afprøvning af den udviklede metode er beskrevet i nedenstående samt i delrapport nr. 8.

I den endelige afprøvning af den udviklede metode indgik prøver fra 50 sædopsamlinger (37 forskellige orner).

Koncentrationen af sædceller i hver opsamling blev bestemt ved tælling i et Thomahæmocytometer. Tællingen blev foretaget ved, at der - med en konstant fortyndingsgrad - blev fremstillet en fortyndet sædopløsning, hvorefter tællekammeret (Thomahæmocytometret) blev fyldt med den fortyndede sædopløsning. Tællekammeret blev derefter anbragt i mikroskop, og ved 400 ganges forstørrelse blev antallet af sædceller i et givet rumfang (0,02 mm³) talt. Tællingerne blev udført som egentlige dobbeltbestemmelser, idet to personer uafhængigt af hinanden har udført hver en tælling pr. opsamling. Der er således foretaget to tælle-fortyndinger, to kammerfyldninger og to tællinger for hver fortyndet sædopløsning.

Sideløbende blev der udarbejdet standardmåling og fortyndingsrækker med fem fortyndinger for hver opsamling til såvel fotometer som fluorometer (Hoechst og DAPI) for at kunne opstille ligningen for standardkurven ved de tre metoder.

I fotometerstandardmålingen anvendtes en 40 ganges fortynding. I fluorometerstandardmålingen anvendtes en 200 ganges fortynding ved Hoechst-metoden (metodebeskrivelse for Hoechst 33258 fluorometermålemetoden fremgår af bilag 1) og en 80 ganges fortynding ved DAPI-metoden (metodebeskrivelse for DAPI-fluorometermålemetoden fremgår af bilag 2).

Fortyndingsrækkerne fremstilledes på baggrund af koncentrationen bestemt ved tælling.

På baggrund af koncentrationen bestemt ved tælling fremstilledes et såkaldt forlag til fotometret med en forventet koncentration på ca. 20 mio. sædceller pr. ml. Herudfra fremstilledes fortyndingsrækken for fotometret (tabel 1).

Tabel 1. Fortyndingsrække til fotometer
Fotometerforlag, ml	Fortynder, ml
1,75	8,25
2,70	7,30
4,00	6,00
6,00	4,00
8,90	1,10

På baggrund af koncentrationen bestemt ved tælling fremstilledes et Hoechst-fluorometerforlag med en forventet koncentration på ca. 4 mio. sædceller pr. ml. Ud fra dette forlag blev fortyndingsrækken for Hoechst fluorometermålingen (tabel 2) fremstillet. Tilsvarende fremstilledes et DAPI-fluorometerforlag med en forventet koncentration på ca. 10 mio. sædceller pr. ml. Ud fra dette forlag fremstilledes fortyndingsrækken for DAPI-fluorometer målingen (tabel 2).

Ved måling i fluorometret tilsattes henholdsvis 2,00 ml Hoechst-farveopløsning og 3,00 ml DAPI-farveopløsning, således at totalrumfanget i begge tilfælde blev 4,00 ml.

Tabel 2. Fortyndingsrække til fluorometer
Hoechst			DAPI
Fluorometerforlag Hoechst, ml	Fortynder-Hoechst, ml	Fluorometerforlag DAPI, ml		Fortynder-DAPI, ml
0,35	1,65	0,15		0,85
0,50	1,50	0,22		0,78
0,75	1,25	0,32		0,68
1,15	0,85	0,48		0,52
1,70	0,30	0,70		0,30

Ud over ovenstående fluorometer-målinger blev der dagligt foretaget blindværdi-målinger for såvel Hoechst som DAPI. Blindværdien er et udtryk for, hvor stort et måle-udslag der stammer alene fra fortynder og farveopløsninger.

RESULTATER OG DISKUSSION

Der blev udtaget prøver fra 50 opsamlinger (fra 37 forskellige orner) med extinktionsværdier fra 0,11 til 0,65 (stan-dardaflæsning i fotometer).

Tidligere undersøgelser har vist, at der er en sammenhæng mellem fotometerudslag og koncentration bestemt ved tælling, og at der opnås en lineær sammenhæng ved transformation af måleværdierne med den naturlige logaritme (ln).

Det ses umiddelbart af figurerne, at der er stor spredning for såvel fotometer som for begge fluorometer-metoderne, når standardmålingerne sammenholdes med koncentrationen fundet ved tælling. For alle tre metoder gælder, at punkterne burde have ligget omkring en ret linie. (Figur 1 - 3 er ikke medtaget i denne tekst, men kan rekvireres ved henvendelse til: Landsudvalget for Svin, DANSKE SLAGTERIER, Axeltorv 3, 9 København V., tlf. 33 11 60 50. (Red.))

Sammenhængen mellem koncentrationen bestemt ved tælling og foto- henholdsvis fluorometerudslag kan beskrives ved formlen: Koncentrationen = exp(a + b ´ ln(udslaget)). Tilpasset en ret linie til punkterne på figur 1 - 3 angiver a skæringen og b hældningen.

For hver opsamling er der udarbejdet en fortyndingsrække, og for hver af disse er den bedste rette linie gennem fortyndingsrækkepunkterne blevet bestemt ved simpel regression.

Den endelige hældning er angivet som et gennemsnit af hældningerne fra hver fortyndingsrække, i alt 50.

Tabel 3. Hældning for standardkurven til fotometret og fluorometret (to metoder)

Fotometer

Fluorometer,

Hoechst

Fluorometer,

DAPI

Hældning

(spredning)

0,9392

(0,0303)

0,5006

(0,0897)

0.6791

(0,0576)

Tabel 4. Skæring for standardkurven til fotometret og fluorometret (to metoder)

Fotometer

Fluorometer,

Hoechst

Fluorometer,

DAPI

Skæring

(spredning)

9,158

(0,1646)

7,224

(0,3931)

5,222

(0,255)

Spredningen på hældningen var lidt lavere ved fotometermetoden end ved de to fluo-rometermetoder.

Skæringen blev estimeret ud fra sammenhørende bestemmelser af koncentrationen fundet ved tælling (T) og fotometerværdi henholdsvis fluorometerværdi (F): Skæring = ln(T) - b´ln(F).

Der indgår værdier fra 50 opsamlinger.

Spredningen på bestemmelsen af skæringspunktet er noget større for fluorometermetoderne end for fotometret.

Den statistiske bearbejdning er også blevet foretaget efter blindværdi-korrektion af de to fluorometer-metoder. I Hoechst-metoden blev korrigeret med et gennemsnit for blindværdierne gennem hele forsøget (= 75). I DAPI-metoden blev korrigeret med den faktiske blindværdi for den pågældende forsøgsdag. Korrektionen ændrede ikke væsentligt på resultaterne.

Koncentration ved fotometermetoden kan herefter beregnes ud fra følgende ligning:

Konc = exp(9,158 + 0,9392 ´ ln(fotometeraflæsning)).

Koncentration ved fluorometermetoden med Hoechst-farvestoffet kan beregnes ud fra følgende ligning:

Konc = exp(7,224 + 0,5006´ ln(fluorometeraflæsning, Hoechst)).

Koncentration ved fluorometermetoden med DAPI-farvestoffet kan beregnes ud fra følgende ligning:

Konc = exp(5,222 + 0,6791705´ ln(fluorometeraflæsning, DAPI)).

Forskellen mellem koncentrationen fundet ved tælling og koncentrationen fundet ved fotometri er et udtryk for overensstemmelsen mellem de to metoder; tilsvarende gælder for forskellen mellem tællekoncentration og fluorometerkoncentration bestemt henholdsvis med DAPI og med Hoechst.

Koncentrationsbestemmelse ved de to fluorometermetoder afveg mere fra koncentrationen bestemt ved tælling end fotometret. Spredningen på Hoechst-metoden var i denne undersøgelse væsentlig større end på fotometret. Spredningen på DAPI-metoden var også større end ved fotometer-metoden, selv om spredningen på DAPI-metoden var klart mindre end på Hoechst-metoden.

Resultatet i denne undersøgelse underbygger resultatet i den foregående undersøgelse (beskrevet i delrapport nr. 7).

Fluorescensmetoden kan på baggrund af denne undersøgelse ikke umiddelbart anbefales til koncentrationsbestemmelse af ornesæd. Det skal dog nævnes, at der eventuelt er mulighed for at udvikle fluorescens-metoden til også at kunne skelne mellem levende (ubeskadigede) og døde (beskadigede) sædceller. I ubeskadigede sædceller trænger fluorochromerne ikke gennem cellemembranen. Der dannes derfor ikke noget fluorescerende DNA-farve kompleks, da DNA'et ligger beskyttet i sædcellekernen. Selv om spredningen på koncentrationsbestemmelsen ved fluorometri tilsyneladende er mindst lige så stor som ved fotometri, er der altså muligvis vigtige ekstra informationer at hente om sæden ved anvendelse af en fluoroescens-metodik.

BILAG 1

Metodebeskrivelse for fluorometer-måling af sædcellekoncentrationen i ornesæd med HOECHST 33258

Apparatur:	Fluorometer:	PERKIN ELMER LS 50B
	Cuvetter:	Engangs-polystyrencuvetter, 4 ml.

Farve og bølgelængde

Fluorochrome	Extinction	Emission
Hoechst 33258	355 nm	470 nm

med en båndbredde på 5nm.

Kemikalier: 1) NaCl, Natriumklorid p.a.

2) C4H11NO3, TRIS(hydroxymethyl)-aminomethan p.a.

3) C25H37N6O6Cl3, Bisbenzimide HOECHST H33258 (Fluorochrome)

4) C10H14N2Na2O8·2 H2O, EDTA-dinatriumsalt (Titriplex III) p.a.

5) ionbyttet H2O fx Milli-Q vand

6) C6H8O7·1 H2O, citronsyre-1-hydrat

7) NaOH, 10 N natrium-hydroxid

Reagenser: a) EDTA-buffer

5,8 gram natriumklorid (1), 1,21 gram TRIS (2), 5,00 gram citronsyre (7) og

3,722 gram EDTA (4) opløses med vand (5) ad 1.000 ml. Der tilsættes

natrium-hydroxid (7) til pH 7,4 (pH-meter). Bufferen fremstilles frisk før hver

analyserunde.

b) Farve-opløsning

0,01 gram Bisbenzimide (3) opløses og fortyndes med EDTA-buffer (a) ad 100

ml.

Fremstilles frisk før hver analyserunde.

Fremgangsmåde: En mængde af farveopløsningen (b) fortyndes 50 gange med EDTA-buffer (a).

Prøverne med en fotometerværdi på 15 - 50 fortyndes 50 gange med EDTA-

buffer (a).

Umiddelbart herefter afpippeteres 2 ml fortyndet prøve og 2 ml fortyndet

farveopløsning i 1 cm's plastkuvette. Låg sættes på kuvetten og denne vendes

manuelt 20 gange for at blande prøve og farve. Herefter placeres kuvetten i

mørke ved stuetemperatur i 5 minutter (stopur). Herefter måles fluorescens-

intensiteten ved en exitationsbølgelængde på 355 nm og en emmisions-

bølgelængde på 470 nm - begge med en båndbredde (spalteåbning) på 5 nm.

BILAG 2

Metodebeskrivelse for fluorometer-måling af sædcellekoncentrationen i ornesæd med DAPI-reagens.

Apparatur:	Fluorometer:	Perkin Elmer LS 50B
	Cuvetter:	Engangs-polystyrencuvetter, 4 ml.

Farve og bølgelængde

Fluorochrome	Extinction	Emission
DAPI	345 nm	445 nm

med en båndbredde på 5nm.

Kemikalier: 1) NaCl, Natriumklorid p.a.

2) C4H11NO3, TRIS(hydroxymethyl)-aminomethan p.a.

3) C10H14N2Na2O8·2 H2O, EDTA-dinatriumsalt (Titriplex III) p.a.

4) ionbyttet H2O fx Milli-Q vand

5) C6H8O7·1 H2O, citronsyre-1-hydrat

6) NaOH, 10 N natrium-hydroxid

Reagenser: a) EDTA-buffer:

5,8 gram natriumklorid (1), 1,21 gram TRIS (2), 5,00 gram citronsyre (6) og

3,722 gram EDTA (3) opløses med vand (4) ad 1.000 ml + 0,1 ml nonidet P

40. Der tilsættes natrium-hydroxid (6) til pH 7,4 (pH-meter). Bufferen

fremstilles frisk før hver analyserunde.

b) farve-opløsning: 2mM DAPI-opløsning:

A: 1,4 mg DAPI opløses i 100 ml EDTA-buffer (a)

B: 10 ml of A opløses i 190 ml EDTA-buffer (a)

(molekyl-vægten for DAPI er 350,2)

Alle reagenser fremstilles frisk før hver analyserunde.

Fremgangsmåde: 2 ml råsæd fortyndes med 48 ml EDTA-buffer (a). Fra denne opløsning

udtages 1 ml, som fortyndes med 3 ml farve-opløsning (b) i en engangs-

cuvette. Fluorescenssignalet aflæses efter 30 sekunder.

Målingerne foretages ved stuetemperatur.