Effekt af nedkølingsmetode og opbevaringstemperatur på motiliteten i ornesæd

SAMMENDRAG

Effekten af nedkølingsmetode og opbevaringstemperatur på motiliteten i færdigfortyndet ornesæd blev undersøgt ved sammenligning af motiliteten i sæd, opbevaret ved to forskellige temperaturer, henholdsvis 16 og 22 grader celcius, og fortyndet efter tre forskellige fortyndingsprocedurer.

I undersøgelsen, der blev gennemført på Hatting Ringsted, indgik 76 sædopsamlinger fra 62 orner.

Opbevaringstemperaturen (16 grader celcius eller 22 grader celcius) havde ingen effekt på motiliteten i den færdigfortyndede sæd.

Fortyndingsproceduren havde 48 timer efter opsamling ikke statistisk sikker effekt på motiliteten. Derimod var der en effekt af fortyndingsproceduren såvel 72 som 96 timer efter opsamling. Den fortyndingsprocedure, hvor et cirka 30 grader celcius varmt forlag blev færdigfortyndet med 20 grader celcius varm fortynder, havde det laveste fald i motilitet. Det vil sige, at 72 og 96 timer efter opsamling havde sæd fortyndet på denne måde den bedste motilitet.

Trods den statistiske sikkerhed i motilitetsfald var der tale om små forskelle, som kun medførte en begrænset reduktion i antallet af levende sædceller i inseminationsdosen. Da det var et laboratorieforsøg, hvor kun motiliteten blev anvendt som måleparameter, kan det ikke umiddelbart forsvares at ændre på den nuværende fortyndingsprocedure på KS-stationerne. Før en eventuel ændring af procedure kan komme på tale, skal der udføres insemineringsforsøg, hvor reproduktionsresultaterne med sæd fortyndet efter forskellige procedurer opgøres og sammenlignes.

BAGGRUND

Både sædcellers motilitet (fremadbevægelse) og integritet (uden beskadigelser) angives at være afhængig af bl.a. nedkølingsmetode og opbevaringstemperatur.

Motiliteten er betinget af, at sædcellerne er i besiddelse af energi. Da sædcellernes energireserver/evne til at gendanne energi er begrænsede, skal det ved opbevaring af sæden tilstræbes, at sædcellernes energiforbrug er så lavt som muligt. Sædceller i bevægelse forbruger mere energi end ubevægelige sædceller. Bevægelsesintensiteten falder med faldende temperatur.

Den nedre temperaturgrænse for opbevaring af ornesædceller er cirka 15 grader celcius. Udsættes ornesædceller for lavere temperaturer ses irreversible beskadigelser, det vil sige, at beskadigelserne trods stigende temperatur ikke udbedres igen.

I en forundersøgelse af forskellige nedkølingsmetoders og opbevaringstemperaturers indflydelse på sædcellernes motilitet og integritet var der en tendens til, at motiliteten faldt langsomst ved en konstant, lav opbevaringstemperatur (20 grader celcius). Der blev ikke påvist forskelle i integritet.

Formålet var derfor på et større materiale at undersøge, om en hurtig nedkøling og efterfølgende opbevaring af sæden ved konstante, lave temperaturer havde en effekt på sædcellernes motilitet. Procedurerne for forarbejdning skulle herigennem optimeres for derved at begrænse faldet i motilitet ved opbevaring af den færdigfortyndede sæd.

MATERIALE OG METODE

Undersøgelsen, der blev gennemført på Hatting Ringsted, omfattede 76 sædopsamlinger (fire pr. dag) fra 62 forskellige orner.

Stationens sædvanlige arbejdsprocedure blev fulgt indtil forlaget var færdigt, det vil sige, sæden var forfortyndet således, at 25 ml forlag indeholdt 2 milliarder motile sædceller. Temperaturen i forlaget var cirka 30 grader celcius.

Forlaget blev delt i tre:

Fortyndingsprocedure 1:

Færdigfortynding med 30 grader celcius varm fortynder (nuværende metode).

Fortyndingsprocedure 2:

Færdigfortynding med 20 grader celcius varm fortynder.

Fortyndingsprocedure 3:

Køling på vandbad til 20 grader celcius før færdigfortynding med 20 grader celcius varm fortynder.

Hver sæddose var på cirka 85 ml og indeholdt 2 mia. levende, fremadbevægelige sædceller.

En dose fra hver fortynding blev opbevaret konstant ved 22 grader celcius og én konstant ved 16 grader celcius, det vil sige, at der for hver opsamling var tre doser ved 22 grader celcius og tre doser ved 16 grader celcius. Alle doser til opbevaring ved 22 grader celcius fra samme dag blev pakket i en styroporbox. Med fire opsamlinger pr. dag og tre doser pr. opsamling indeholdt hver styroporbox 12 doser; tilsvarende for doser til opbevaring ved 16 grader celcius.

Temperaturen i thermoskabene blev kontrolleret ved hjælp af en Grant datalogger. Ved hjælp af følere placeret i begge thermoskabe blev temperaturen i skabene registreret samtidigt med et givet tidsinterval. Der blev foretaget kontrolmålinger af temperaturerne i to perioder med henholdsvis seks og fire timers intervaller.

Motiliteten blev vurderet for hver opbevaringstemperatur og fortyndingsprocedure henholdsvis 48, 72 og 96 timer efter opsamling. Motilitetsvurderingen blev foretaget efter reaktivering af sæddoserne, det vil sige, at doserne blev anbragt i vandbad ved 35 grader celcius i 30 minutter før vurdering.

Vurderingerne blev foretaget i fasekontrastmikroskop ved 200 ganges forstørrelse. Der var tale om subjektive vurderinger, hvor samme person foretog alle vurderingerne. Motilitets-vurderingerne blev foretaget efter en skala fra 0 til 90 med intervaller på 10 (samme skala som rutinemæssigt anvendes på KS-stationerne). Kun sæd med god fremadbevægelse og få defekte sædceller blev vurderet til "motilitet 90". Sæd med dårligere bevægelse og/eller flere defekte sædceller blev vurderet til "motilitet 80", "motilitet 70" eller eventuelt lavere.

RESULTATER OG DISKUSSION

Alle analyser blev foretaget på motilitetsforskelle beregnet som udgangsmotiliteten (tid=0) minus motiliteten vurderet henholdsvis 48, 72 og 96 timer efter opsamling. Herved udelukkes effekten af forskelle i sædkvaliteten i de opsamlinger, som indgik i undersøgelsen. I denne undersøgelse var der ikke vekselvirkninger mellem fortyndingsprocedure og opbevaringstemperatur.

Fortyndingsproceduren havde 48 timer efter opsamling ikke statistisk sikker indflydelse på motilitetsfaldet. Derimod var motilitetsfaldet efter 72 timer statistisk sikkert lavere ved fortyndingsprocedure 2 end ved procedure 1 (p=.002) og procedure 3 (p=.006). Tilsvarende påvistes motilitetsfaldet efter 96 timer at være statistisk sikkert lavere ved procedure 2 end ved procedure 1 (p=.001) og procedure 3 (p=.005). Såvel 72 som 96 timer efter opsamling var motiliteten i den sæd, der var fortyndet efter procedure 2, altså bedre end motiliteten i den sæd, der var fortyndet efter procedure 1 eller procedure 3.

Tabel 1. Gennemsnitligt motilitetsfald for hver fortyndingsprocedure
Fortyndingsprocedure (forlagstemp./fortynd.temp.)	Gennemsnitligt fald i motilitet efter *
	48 timer	72 timer	96 timer
1 (30 grader/30 grader)	10,7	18,8	34,0
2 (30 grader/20 grader)	9,6	16,4	30,3
3 (20 grader/20 grader)	11,0	18,6	33,4

* Hvert gennemsnit er beregnet på baggrund af 152 vurderinger.

Tabel 2. Gennemsnitligt motilitetsfald for hver opbevaringstemperatur
Opbevarigstemp.	Gennemsnitligt fald i motilitet efter*
	48 timer	72 timer	96 timer
16 grader celcius	10,6	17,9	32,4
22 grader celcius	10,3	17,9	32,7

* Hvert gennemsnit er beregnet på baggrund af 228 vurderinger.

Opbevaringstemperaturen havde ikke statistisk sikker indflydelse på motilitetsfaldet. I denne undersøgelse blev der således ikke påvist forskelle i holdbarheden (udtrykt ved motiliteten) af sæden ved de to opbevaringstemperaturer.

Sædens befrugtningsevne kan ikke udtrykkes ved hjælp af motiliteten alene, men motiliteten er den bedst afprøvede laboratorie-parameter til vurdering af befrugtningsevnen. En høj motilitet giver dog ingen garanti for gode reproduktionsresultater.

Et fald i motiliteten i den færdigfortyndede sæd i størrelsesordenen fra 1 til 4 pct. svarer til, at antallet af motile sædceller i dosen reduceres med fra 20 til 80 millioner. Der er - trods de statistisk sikre forskelle - tale om en relativt lille reduktion i antallet af motile sædceller.

Forskellene i motilitetsfald øges i takt med, at sædens alder stiger. Dette er helt i overensstemmelse med, hvad der forventes, og netop derfor blev der her i undersøgelsen foretaget motilitetsvurderinger helt op til 96 timer efter opsamling. I praksis anbefales det, at sæden anvendes indenfor tre døgn efter opsamling, og langt det meste anvendes indenfor de første 48 timer.

Det er derfor ikke realistisk at tro, at en ændring af fortyndingsproceduren fra den nuværende procedure (procedure 1) til procedure 2 vil medføre forbedrede reproduktionsresultater.

Da der er tale om et rent laboratorieforsøg, hvor kun en parameter er undersøgt, kan det ikke umiddelbart forsvares at ændre den nuværende procedure på KS-stationerne. Før sådanne ændringer kan iværksættes, skal der udføres insemineringsforsøg med efterfølgende sammenligning af faringsprocent og kuldstørrelse for hver procedure.

Effekt af nedkølingsmetode og opbevaringstempera­tur på motiliteten i ornesæd

Effekt af nedkølingsmetode og opbevaringstemperatur på motiliteten i ornesæd