Der var positiv effekt på sædens bevægelighed, når sæden blev både for – og slutfortyndet med 20 grader varm fortynder.

Produktionen af sæddoser skal være så skånsom som muligt for sæden. I den proces er det vigtigt at være opmærksom på:

kvaliteten af fortynder
materialer som sæden kommer i kontakt med
hygiejne
temperaturen på fortynderen, når sæden fortyndes.

Formålet med denne afprøvning var at klarlægge effekten af temperaturen i for- og slutfortynder på sædens bevægelighed målt med computer assisted sperm analysis (CASA) på 3. dagen efter sædopsamling.

Afprøvningen var opdelt i to delundersøgelser. Hver delundersøgelse omfattede sæd fra i alt 20 orner. Sæden blev for- og slutfortyndet med EDTA-ornesædsfortynder med forskellige temperaturer. Normal procedure for KS-stationer er for-fortynding med 30 grader varm fortynder og slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Dette blev sammenlignet med for- og slutfortynding med 20 eller 30 grader varm fortynder.

Der sås positiv effekt på sædens bevægelighed med fortynding af sæd med 20 grader varm fortynder ved både for- og slutfortynding af sæden i forhold til de andre anvendte temperaturer.

Baggrund

Produktionen af sæddoser skal være så skånsom som muligt for sæden. I den proces er det vigtigt at være opmærksom på kvaliteten af fortynder og de materialer som sæden kommer i kontakt med samt hygiejnen, men også temperaturen på fortynderen når sæden fortyndes.

Selve fortyndingsprocessen af sæden sker i dag i to trin – en for-fortynding og slutfortynding. DanAvls KS-stationer anvender til for-fortyndingen 30 grader varm EDTA-ornesædsfortynder [1]. Normal praksis for KS-stationerne er anvendelse af 20 grader varm fortynder ved slut-fortyndingen. Normalt slut-fortyndes sæden inden for cirka en time efter for-fortynding. Det tidsrum er tilstrækkeligt til, at for-fortyndet sæd til tider nedkøles til cirka 22 grader inden slutfortyndingen.

Hvis der anvendes materialer eller procedurer i produktionen af sæddoser, som er skadelige for sædcellerne, kan sædcellerne miste evnen til at befrugte. I laboratoriet kan det ikke lade sig gøre at måle om enkelte sædceller har mistet evnen til at befrugte, men der findes flere metoder til at undersøge om sæden kunne have reduceret frugtbarhed. Disse metoder omfatter som eksempel måling af om sædcellerne er levende [2] eller sædcellernes svømmehastighed [3], [4]. Nyere studier hos Videncenter for Svineproduktion har tillige vist, at måling af sædcellernes bevægelighed på 3. dagen målt med computer assisted sperm analysis (CASA)har sammenhæng til kuldstørrelsen (data ikke publiceret).

Formålet var at undersøge effekten af temperaturen i for- og slutfortynder på sædens bevægelighed målt med computer assisted sperm analysis (CASA) på 3. dagen efter sædopsamling.

Materiale og metode

Afprøvningen omfattede to separate delundersøgelser (tabel 1). Hver delundersøgelse omfattede sæd fra 10 forskellige orner fra henholdsvis Landrace og Yorkshire. Sæden blev opsamlet, behandlet i overensstemmelse med reglerne for avl drift og smittebeskyttelse for KS-stationer [1]. Al sæden var desuden godkendt i henhold til førnævnte regler for KS-stationerne. Temperaturen i sæden blev kontrolleret med IR-termometer +/- 0,5 graders nøjagtighed umiddelbart efter sædopsamling, ved for-fortynding samt slutfortynding.

Delundersøgelse 1

Efter sædopsamling blev råsæden omhældt til en 2 liter polyethylen (PE) dunk. Sædens motilitet blev bestemt i henhold standardmetode for DanAvls KS-stationer [1]. Sædkoncentrationen blev bestemt med NucleoCounter SP100, ved udtagelse af 50µl sæd, som blev fortyndet med 10,00 ml S100 Reagens og analyseret i instrumentet. Efterfølgende blev sæden fortyndet i PE dunken med 30 grader varm fortynder til en koncentration på 80 mio. motile sædceller pr. ml (for-fortynding).

Fra PE dunken med for-fortyndet sæd blev produceret en sæddose til hver af grupper 1 og 2. Dunken med for-fortyndet sæd blev efterfølgende hensat ved cirka 20 grader indtil temperaturen i sæden havde nået cirka 22 grader. Efterfølgende blev en dose til gruppe 3 produceret.

Sæddoserne blev produceret ved at tilsætte 56 ml fortynder til en sædpose, hvorefter 25 ml for-fortyndet sæd blev tilsat. Sædposen blev straks herefter lukket og lagt til opbevaring ved 17 grader og efter tre dage analyseret med SpermVision CASA System.

Delundersøgelse 2

Efter sædopsamling blev råsæden omhældt til en 2 liter polyethylen (PE) dunk. Sædens motilitet blev bestemt i henhold standardmetode for DanAvls KS-stationer [1]. Sædkoncentrationen blev bestemt med NucleoCounter SP100, ved udtagelse af 50µl sæd, som blev fortyndet med 10,00 ml S100 Reagens og analyseret i instrumentet.

Herefter blev 20 ml råsæd fordelt til hver af tre forskellige 2 liters PE dunke. Sæden i hver dunk blev henholdsvis for-fotyndet og slutfortyndet i henhold til forsøgsdesign som beskrevet i tabel 1. Slutfortyndet sæd blev fyldt på sæddoser som beskrevet under delundersøgelse 1. Sæddoserne blev opbevaret ved 17 grader og analyseret med SpermVision CASA System på 3. dagen efter sædopsamling.

Analyse med SpermVision
Fra hver blev cirka 10 ml sæd omhældt til 10 ml NUNC-rør til varme-reaktivering af sæden. Ved varmereaktivering blev sæden opbevaret i 38 grader varmt vandbad i 50±5 minutter.

Efter varmereaktivering blev udtaget 2,3 µl sæd som blev overført til 20 µm dybt Leja-4 tællekammer. Sædens bevægelighed blev analyseret straks med SpermVision CASA System i henhold til standardmetode som beskrevet ved en tidligere afprøvning [5]. Sæd fra alle NUNC rør blev analyseret to gange. For hver sædcelle blev registreret gennemsnitlig drejning af sædcellehovedet (AOC) samt gennemsnitlig svømmehastighed (VCL). Hver analyse omfatter måling af cirka 600-1.000 sædceller.

Tabel 1. Oversigt over forsøgsdesign for delundersøgelse 1 og delundersøgelse 2

Delundersøgelse 1
Gruppe	Temperatur på fortynder ved for-fortynding	Behandling af sæden mellem for- og slutfortynding	Temperatur på fortynder ved slutfortynding
1 (Kontrol)	30 °C	Slutfortynding straks	20 °C
2	30 °C	Slutfortynding straks	30 °C
3	30 °C	Nedkøling til 22 grader	20 °C
Delundersøgelse 2
Gruppe	Temperatur på fortynder ved for-fortynding	Behandling af sæden mellem for- og slutfortynding	Temperatur på fortynder ved slutfortynding
1a (kontrol)	30 °C	Slutfortynding straks	20 °C
2a	20 °C	Slutfortynding straks	20 °C
3a	30 °C	Nedkøling til 22 grader	20 °C

Statistik

Sædceller blev karakteriseret som bevægelige ved AOC>5. For bevægelige sædceller blev der for hver analyse beregnet sædens bevægelighed og karakterisering af sædcellernes bevægelsesmønster (se tabel 2 og figur 1).

Tabel 2. Definition af afhængige variable i den statistiske analyse

AOC	Average Orientation Change angiver gennemsnitlig drejning af sædcellens hoved.
Sædcellernes bevægelighed	Alle sædceller med AOC > 5 grader er bevægelige. Kun bevægelige sædceller er medtaget i analyser af sædcellernes hastighed og bevægelsesmønster.
VCL	Velocity Curved Line angiver sædcellens direkte svømmehastighed i analysen (figur 1). VCL for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse.
R-VCL	Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne.
VSL	Velocity Straigh Line angiver hastigheden for sædcellens bevægelse fra startpunktet til slutpunktet i analysen (figur 1). VSL for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse.
R-VSL	Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne.
VAP	Velocity Average Path angiver sædcellens gennemsnitlige svømmehastighed som udglattet linie (figur 1). VAP for en analyse er angivet som medianen for pågældende analyse.
R-VAP	Anvendes som mål for variationen mellem sædceller i en analyse. R-VCL er range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne.
LIN	Linearity angiver forholdet mellem VSL og VCL og udtrykker om sædcellen har en lige bevægelse eller svøm-mer i ring.
STR	Straightness angiver forholdet mellem VSL og VAP og udtrykker om sædcellen har en lige fremadrettet bevægelse.

Figur 1. Skematisk oversigt over definitioner af hastighedsmålinger for sædcellens bevægelsedescriptiondescription

Data blev analyseret med mixed model analysis i SAS version 9.13. Analysen kan beskrives ved følgende model:

Y_ijk= μ + A_i+ B_j+ w_k + e_ijk

Y er den afhængige variabel. ”μ” angiver det generelle gennemsnit for henholdsvis sædens bevægelighed, VCL og R-VCL, A_i henviser til, om prøven er kontrol- eller forsøgsgruppe, B_j angiver om prøven er fra en Landrace eller Yorkshire orne, w_k angiver tilfældig variation mellem sædopsamlinger fra de forskellige orner og e_ij er residualvariationen (antages normalt fordelt).

Temperaturen af sæd og fortynder er beregnet som gennemsnit med standardafvigelse for alle sædopsamlingerne inden for hver af grupperne.

Resultater og diskussion

Gennemsnit for temperaturen på sæd og fortynder i fortyndingsprocessen svarede til det forventede (tabel 3). Temperaturen i sæden var godt 30 grader umiddelbart efter sædopsamling.

Tabel 3. Oversigt over temperatur i sæd og fortynder ved fortyndingen af sæden.

Delundersøgelse 1
Gruppe	Ved for-fortynding – temperatur i	-	Ved slutfortynding – temperatur i	-
-	Sæden	Fortynder	For-fortyndet sæd	Fortynder
1 (kontrol)	33,8 ± 1,9 ºC	29,9 ± 0,4 ºC	-	20,1 ± 0,4 ºC
2	33,8 ± 1,9 ºC	29,9 ± 0,4 ºC	-	29,9 ± 0,4 ºC
3	33,8 ± 1,9 ºC	29,9 ± 0,4 ºC	22,2 ± 1,3 ºC	20,1 ± 0,4 ºC
Delundersøgelse 2
Gruppe	Ved for-fortynding – temperatur i	-	Ved slutfortynding– temperatur i	-
-	Sæden	Fortynder	For-fortyndet sæd	Fortynder
1 (kontrol)	33,5 ± 1,5 ºC	30,0 ± 0,7 ºC	-	19,5 ± 0,5 ºC
2	33,5 ± 1,5 ºC	19,5 ± 0,5 ºC	-	19,5 ± 0,5 ºC
3	33,5 ± 1,5 ºC	30,0 ± 0,7 ºC	22,3 ± 0,3 ºC	19,7 ± 0,3 ºC

Sæden i gruppe 1 og 2 i begge delundersøgelser blev for- og slutfortyndet straks. Temperaturen i den for-fortyndede sæd umiddelbart inden slutfortyndingen er derfor ikke målt. Sæden i gruppe 1 og 2 i begge delundersøgelser blev slutfortyndet inden for cirka 5 minutter efter sæden var leveret til laboratoriet.

Der sås i undersøgelsen ingen forskelle mellem grupperne ved måling af VSL, R-VSL, VAP, R-VAP, STR eller LIN. Estimater for disse parametre er ikke vist.

Der var forskel i svømmehastigheden for sædcellerne fra henholdsvis Landrace og Yorkshire orner, hvilket kan være et udtryk for raceforskelle (tabel 4). Derimod er andelen af bevægelige sædceller for orneracerne ikke forskellig, hvilket kan være et udtryk for, at kun et lille antal orner indgik i undersøgelsen. Enkelte orner med lavt antal bevægelige sædceller kan forskubbe resultaterne meget.

Resultaterne fra delundersøgelse 1 viste negativ effekt ved slutfortynding med 30 grader varm fortynder (tabel 4) i forhold til slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Der var derimod ingen forskel om sæden blev slutfortyndet straks med 20 grader varm fortynder, eller om den for-fortyndede sæd blev kølet inden slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Effekten sås både ved et fald i andelen af bevægelige sædceller og svømmehastigheden for de bevægelige sædceller (VCL). Behandlingen medførte ikke, at populationen af sædceller i en prøve blev mere uens i svømmehastigheden, idet R-VCL ikke blev påvirket af behandlingen.

Tabel 4. Oversigt over resultater for analyse af andelen af bevægelige sædceller, median for sædcellernes svømmehastighed (VCL) samt range mellem 25 pct. og 75 pct. kvartilerne for VCL (R-VCL).

Delundersøgelse 1
Gruppe	Andelen af bevægelige sædceller	VCL	R-VCL
Gruppe 1	65,1 pct. ^a	112,1 µm/sek.	91,9 µm/sek.
Gruppe 2	59,2 pct. ^b	108,7 µm/sek.	90,6 µm/sek.
Gruppe 3	64,8 pct. ^a	112,4 µm/sek.	90,2 µm/sek.
Landrace orner	72,1 pct. ^a	121,0 µm/sek. ^a	96,4 µm/sek. ^a
Yorkshire orner	54,0 pct. ^b	101,1 µm/sek. ^b	85,4 µm/sek. ^b
Delundersøgelse 2
-	Andelen af bevægelige sædceller	VCL	R-VCL
1 (kontrol)	74,3 pct. ^a	109,7 µm/sek.	78,3 µm/sek.
2	76,9 pct. ^b	109,9 µm/sek.	78,4 µm/sek.
3	74,1 pct. ^a	109,0 µm/sek.	78,9 µm/sek.
Landrace orner	74,6 pct.	110,6 µm/sek.	78,9 µm/sek.
Yorkshire orner	75,5 pct.	89,2 µm/sek.	78,2 µm/sek.

Forskelligt bogstav i hævet skrift indikerer statistisk sikker forskel (p<0,05) mellem grupper eller orneracer inden for hver af henholdsvis andelen af bevægelige sædceller, VCL og R-VCL

Resultaterne fra delundersøgelse 2 viste ligeledes ens resultater ved for-fortynding med 30 grader varm fortynder og 20 grader varm slutfortynder, uanset om fortyndingen skete straks eller efter køling af for-fortyndet sæd. Dog sås en øget andel af bevægelige sædceller ved for-fortynding og slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Sædcellernes bevægelseshastighed var den samme for alle grupper. Disse resultater er i modstrid med tidligere undersøgelser [6], som ikke fandt forskel mellem de tre fortyndingsprocedurer som anvendt i denne undersøgelse. Dog blev ved de tidligere undersøgelser anvendt subjektiv vurdering af sædens bevægelighed, hvilket vil kunne have maskeret de relativt små forskelle fundet i denne undersøgelse.

Samlet kan tolkes, at hurtig nedkøling af sædcellerne bevarer sædcellernes evne til at bevæge sig på 3. dagen. Dette kan konkluderes, da andelen af bevægelige sædceller steg, sammenholdt med at ingen andre måleparametre blev påvirket. Resultaterne indikerer således, at sædcellernes bevægelsesmønster, ikke ændres ved den hurtige nedkøling, da behandlingen ikke påvirkede hverken LIN eller STR, som kan opfattes som mål for sædcellernes svømmeretning.

Tidligere undersøgelser har vist, at både sædens bevægelighed, integriteten af plasmamembranen og akrosomet kan tage skade ved køling af sæden [7], samt at faktorer som akrosom og mitokondriel aktivitet også tager skade før bevægeligheden påvirkes [8]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afklare, om disse strukturer i sædcellen tager skade af det kuldechok sædcellerne udsættes for ved for- og slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Det kan derfor ikke endeligt konkluderes, at sædcellernes befrugtningsevne eller sædens holdbarhed vil blive bedre, hvis der anvendes en for- og slutfortynding med 20 grader varm fortynder frem for en for-fortynding med 30 grader varm fortynder og slutfortynding med 20 grader varm fortynder.

Konklusion

Der sås positiv effekt af både for- og slutfortynding med 20 grader varm fortynder. Effekten var lille og kunne måles på andelen af bevægelige sædceller.

Referencer

[1]	Hansen, C. (2009): Regler for avl, drift og smittebeskyttelse på KS-stationer. Manual nr. 6, Dansk Svineproduktion.
[2]	Madsen, M.T., Wachmann H., Johansen, D., Christensen, P. (2002): Vitalitetsbestemmelse af ornesæd ved flowcytometri. Meddelelse nr. 564, Landsudvalget for Svin.
[3]	Holt, C., Holt, W.V., Moore, H.D., Reed, H.C., Curnock, R.M. (1997): Objectively measured boar sperm motility parameters correlate with the outcomes of onfarm inseminations: results of two fertil-ity trials. J Androl;18:312-23.
[4]	Hirai, M., Boersma, A., Hoeflich, A. et al. (2001): Objectively measured sperm motility and sperm head morphometry in boars (Sus scrofa): relation to fertility and seminal plasma growth factors. J Androl;22:104-10.
[5]	Hansen, C. (2008): Validering af SpermVision CASA System til måling af ornesædcellers bevægelighed. Rapport nr. 31, Dansk Svineproduktion.
[6]	Vesterager, L. (1993): Effekt af nedkølingsmetode og opbevaringstemperatur på motiliteten i ornesæd. Meddelelse nr. 266, Landsudvalget for Svin.
[7]	White, I.G. (1993): Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold shock and preservation: a review. Reprod Fertil Dev;5:639-58.
[8]	Waberski, D. (2009): Personlig meddelelse. Professor i Reproduktionsmedicin hos svin og små ruminanter, University of Veterinary Medicine Hannover, Germany.

Afprøvningen var delvist finansieret af DanAvls KS-stationer

Deltagere: Laboratorietekniker Cicilie Line Jensen, Hatting-KS, Ringsted

Afprøvning: 1005

Effekt af nedkølingsmetode på sædcellers bevægelighed målt med CASA