Afprøvningen viste bedre holdbarhed for ornesæd opbevaret ved 17 og 21 °C i forhold til opbevaring ved 13 og 24 °C.

Ved svineproduktion i Danmark anvendes i stor udstrækning kunstig sædoverføring (KS). Størstedelen af KS udføres med sæd indkøbt fra en KS-station. Sæd fra KS-stationen skal være så befrugtningsdygtig som muligt, og produktion af sædportioner, samt selve transporten og opbevaringen af sædportionerne må ikke være årsag til forringelse af sædcellernes befrugtningsevne.

Formålet med afprøvningen var at undersøge effekten af opbevaringstemperaturen på sædens motilitet, samt integriteten på sædcellernes plasmamembran 72 timer efter produktion af sædportionerne. I afprøvningen blev anvendt opbevaringstemperaturer på cirka 13, 17, 21 og 24 °C.

Resultaterne viste nedsat motilitet og et fald i andelen af sædceller med intakt plasmamembran ved opbevaringstemperatur lavere end 16-18 °C og højere end 20-22 °C. Der kan ikke ud fra resultaterne konkluderes, at opbevaringstemperatur på 20-22 er bedre end opbevaringstemperatur på 16-18 °C. Dog er en opbevaringstemperatur lidt over 16-18 °C, med konstant temperatur, bedre end en lavere temperatur. Motiliteten og andelen af sædceller med intakt plasmamembran faldt forholdsvis kraftigt ved en opbevaringstemperatur på 12-14 °C.

Baggrund

Ved svineproduktion i Danmark anvendes i stor udstrækning KS, idet KS udgør cirka 76 pct. af samtlige kuld i Danmark. Størstedelen af KS udføres med sæd indkøbt fra en KS-station. Denne sæd fra KS-stationen skal være så befrugtningsdygtig som muligt, og produktion af sædportioner, samt selve transporten og opbevaringen af sædportionerne må ikke være årsag til forringelse af sædcellernes befrugtningsevne.

Landsudvalget for Svins generelle anbefaling for opbevaringstemperatur af sædportioner er 16-18 °C. I produktionen af sædportioner sigtes mod en nedkøling af sæden til cirka 22 °C. Efterfølgende køles sæden langsomt ned til cirka 17 °C, både under opbevaring på KS-stationen samt under transporten. Efter levering af sæden til svineproducenten skal sæden opbevares ved 16-18 °C.

Ved selve produktionen af sædportionerne opnås en temperatur på cirka 22-23 °C i den færdige sædportion. Herefter foregår nedkøling mod 16-18 °C forholdsvis uensartet. Årsagen er, at hver sædportion udgør et lukket rum, adskilt fra alle andre sædportioner. Ved opbevaring af mange sædportioner skal den sædportion, der ligger i midten af bunken, nedkøles af de omkringliggende sædportioner osv. Samtidig har den tynde plastic, som sædposen består af, en isolerende effekt, der hermed betyder en forsinkelse i nedkølingen. Nedkølingen sker således hurtigere for de sædportioner, der ligger yderst.

Nedkølingen af sæden og opbevaringstemperaturen udgør et dilemma. Plasmamembranen i sædcellen består af flydende fedtstoffer, og har dermed stor fleksibilitet. Ved nedkøling bliver membranen mere stiv og ufleksibel, hvilket kan bevirke, at membranen ødelægges ved sædcellens bevægelse. Omvendt er en for høj opbevaringstemperatur også skadelig. Sæden nedkøles for at nedsætte sædcellernes metabolisme. Nedkøling af sæden har således til formål at finde kompromiset mellem lav metabolisme for sædcellerne, så de lever længst muligt, sammenholdt med at selve nedkølingen ikke må være skadelig.

Formålet med afprøvningen var at undersøge effekten af opbevaringstemperaturen på sædens motilitet, samt integriteten på sædcellernes plasmamembran (vitalitet) 72 timer efter produktion af sædportionerne. I afprøvningen blev anvendt opbevaringstemperaturer på cirka 13, 17, 21 og 24 °C.

Materiale og metode

I afprøvningen indgik sæd fra 184 sædopsamlinger fra 119 forskellige orner. Sædopsamlingerne blev gennemført på 19 forskellige dage. Fra hver sædopsamling blev sædportioner produceret i henhold til gældende regler [1]. Efter produktionen blev fem sædportioner udtaget. En enkelt sædportion blev analyseret umiddelbart efter produktionen (t=0), mens de resterende fire portioner blev fordelt i gruppe 1-4 og analyseret 72 timer efter produktionen (t=72). Opbevaringstemperaturen for gruppe 1-4 er beskrevet i tabel 1. Opbevaringstemperaturen blev for hver af grupperne kontrolleret med et certificeret Goldbrand kviksølvtermometer (Danak certifikat nr. 9.10T-0276).

Produktion af sædportionerne

Umiddelbart efter sædopsamling blev ejakulatet vejet og sædens motilitet og koncentration bestemt [1]. Sæden blev senest en time efter sædopsamling for-fortyndet til et forlag indeholdende 2,0 mia. motile sædceller pr. 25 gram. Snarest muligt efter for-fortyndingen blev sæden slutfortyndet til 2,0 mia. i cirka 80 gram. Umiddelbart efter produktionen blev fem sædportioner ud af den samlede produktion fra ejakulatet tilfældigt udvalgt. En enkelt sædportion blev analyseret straks og de fire resterende sædportioner blev fordelt i gruppe 1-4. Efter opbevaring i cirka 72 timer blev sædportionerne i gruppe 1-4 analyseret.

Analyse af sædportionerne

Hver sædportion blev analyseret både for motilitet, sædkoncentration og andelen af sædceller med intakt plasmamembran.

Undersøgelse af sædens motilitet blev udført i henhold til ”Regler for avl, drift og smittebeskyttelse for KS-stationer” [1]. Sæden i sædportionen blev blandet inden sæden blev fordelt i tre forskellige 10,0 ml NUNC-rør (NUNC A/S, Roskilde, Denmark). To rør blev placeret i et 37-39 °C varmt vandbad til reaktivering. Efter reaktivering blev motiliteten undersøgt som blindet dobbeltbestemmelse. Ved vurderingen af motiliteten blev motiliteten angivet i hele 10’er procent med angivelse af årsag til nedsat motilitet, når motiliteten var lavere end 90 pct.

Sæden i det sidste NUNC-rør blev analyseret med flowcytometri, hvor både sædkoncentrationen og andelen af sædceller med intakt plasmamembran blev bestemt. Analysen blev gennemført som beskrevet i en tidligere afprøvning [2]. Andelen af sædceller med intakt plasmamembran angives som procentdel af sædcellerne (vitaliteten).

Statistik

Ved analysen blev motiliteten anvendt uden korrektion for typen af defekt/fejl ved sæden. Forskel mellem grupperne blev analyseret med Wilcoxon Rank Sum test i SAS version 9.1. Tidligt i afprøvningen sås tendens til vekselvirkning mellem opbevaringstemperaturen og motiliteten vurderet umiddelbart efter produktion af sædportionen. Analyserne blev opdelt ud fra motilitetsvurderingen af sædportionerne umiddelbart efter produktion (se tabel 2).

Opbevaringstemperaturens indflydelse på andelen af sædceller med intakt plasmamembran blev analyseret ved variansanalyse med proc mixed i SAS version 9.1. Som afhængig variabel blev anvendt differencen mellem t=0 og t=72 analysen. Analysen blev udført med sædopsamlingen som tilfældig effekt og med korrektion for vekselvirkningen mellem t=0 måling af vitaliteten samt gruppe.

Resultater og diskussion

Kontrollen af temperaturen for de fire forskellige opbevaringsskabe viste meget små udsving i temperaturen (se tabel 1). Der sås kun overskridelse af temperaturen for gruppe 2 og 4, hvor overskridelsen skete henholdsvis to og tre forskellige dage i forsøget. Temperaturen i denne afprøvning har formentlig været mere konstant, end hvad der normalt kan opnås for sædopbevaringsskabe hos svineproducenterne.

Tabel 1. Oversigt over opbevaringstemperaturen

Gruppe	1, (°C)	2, (°C)	3, (°C)	4, (°C)
Ønsket opbevaringstemperatur	12-14	16-18	20-22	23-25
Opnået gennemsnitlig temperatur	13,0	17,7	20,7	24,8
Min./maks.-temperatur	12,2 - 13,5	17,1 - 18,3	20,0 - 21,7	24,1 - 25,5

Det kan forventes, at sæd med meget høj motilitet og vitalitet, måske også er mindre følsom overfor suboptimale forhold. Omvendt kan det også forventes, at suboptimale forhold for sædcellerne er nemmere at vise, hvis sæden i forvejen har lidt lavere motilitet og vitalitet, eller hvis sædcellerne er beskadiget på anden måde. Sædportionerne i afprøvningen kunne inddeles efter dobbeltbestemmelserne af motiliteten ved t=0, således at inddelingen blev til fire grupper med henholdsvis 90/90 i dobbeltbestemmelsen, 80/90, 80/80 og mindst én bestemmelse lavere end 80.

For gruppen 90/90 kunne ikke vises forskel mellem opbevaringstemperaturerne, dog var der numerisk færrest antal sædportioner med fald i motilitet ved t=72 i gruppe 2 (se tabel 2). For gruppen 80/90 faldt motiliteten for stort set alle prøverne, hvorved det ikke er muligt at vise forskelle i opbevaringstemperaturen. Der kunne påvises en tendens til forskel mellem opbevaringstemperaturerne for 80/80 gruppen, idet færre sædportioner faldt i motilitet ved opbevaringstemperaturen i gruppe 2.

Årsagen, til at alle sædportionerne i 80/90 gruppen faldt i motilitet, kan skyldes, at sædportionerne fejlagtigt er blevet vurderet til 90, men skulle have været 80. Årsagen kan ikke være personforskelle, idet samme person har udført både t=0 samt t=72 undersøgelserne.

Tidligere afprøvninger har vist, at opbevaringstemperatur på 22 °C ikke medførte et større fald i sædens motilitet end opbevaringstemperatur på 17 °C [3]. Ved tidligere undersøgelser af opbevaringstemperaturens indflydelse på motiliteten blev der ikke fundet vekselvirkningen mellem sædens motilitet umiddelbart efter produktion og opbevaringstemperaturen. Såfremt analyserne i denne afprøvning ikke blev opdelt efter motiliteten umiddelbart efter produktion, kunne der ikke vises forskel mellem opbevaringstemperaturen. Det fremgår ikke af tidligere afprøvninger, hvor mange procent af prøverne, der blev vurderet til 90 i motilitet umiddelbart efter fortynding, derfor vides det ikke, om vekselvirkningen ville kunne have været påvist.

Tabel 2. Oversigt over fordeling af antal prøver der henholdsvis faldt, forblev uændret eller steg i motilitet efter 72 timers opbevaring. Ændringen ved t=72 er beregnet som gennemsnit af dobbeltbestemmelse

Motilitet efter 0 timer	< 80			80/80			80/90			90/90
Motilitet efter 72 timer *	÷	0	+	÷	0	+	÷	0	+	÷	0	+
Gruppe 1	6	1	0	31	14	2	24	2	1	71	21	0
Gruppe 2	3	2	2	20	19	8	24	1	2	63	29	0
Gruppe 3	6	0	1	29	12	6	24	2	1	70	22	0
Gruppe 4	5	2	0	31	11	5	23	2	2	68	24	0
p-værdi^**	0,2			0,055			0,9			0,5

^* ”-”, ”0” og ”+” angiver om motiliteten henholdsvis var faldet, uændret eller steget efter 72 timers opbevaring.

^** P-værdien for analyse af statistisk sikker forskel mellem grupperne. P<0,05 angiver statistisk sikker forskel.

Figur 1. Vekselvirkning mellem opbevaringstemperatur og vitaliteten ved t=0. Regressionslinier er beregnet ud fra rådata

Ved analyserne blev der for gruppe 1, 2 og 4 fundet et statistisk sikkert fald i andelen af sædceller med intakt plasmamembran, mens der for gruppe 3 ikke kunne påvises et fald. Ydermere blev der fundet vekselvirkning mellem opbevaringstemperaturen og vitaliteten ved t=0. Vekselvirkningen betyder, at sæden opbevaret ved 13 °C faldt mere ved lavere vitalitet ved t=0 end ved anden opbevaringstemperatur (figur 1).

Der var ikke stor forskel mellem gruppe 1, 2 og 3, dog sås statistisk sikker bedst vitalitet ved opbevaring ved 21 °C (p<0,05).

Resultaterne fra analyserne af motilitetsvurderingerne sammenholdt med vitalitetsmålingerne indikerer, at den mest optimale opbevaringstemperatur ligger omkring 16-22 °C. Dog skal opbevaringstemperaturen være konstant med så få udsving i temperaturen som muligt [4]. Resultaterne viser bedst motilitet for sædportioner opbevaret ved 16-18 °C, mens vitalitetsmålingerne viser mindst membranskade på sædcellerne, når opbevaringstemperaturen er 20-22 °C. Hvorvidt sædceller opbevaret ved 20-22 °C har taget skade og derfor ikke bevæger sig, eller om energien i fortynderen er opbrugt, hvilket kunne være årsag til nedsat motilitet, vides ikke.

Ud fra resultaterne i afprøvningen kan det ikke konkluderes, at opbevaringstemperatur på 20-22 °C er bedre end opbevaringstemperatur på 16-18 °C. Dog viser resultaterne, at en opbevaringstemperatur, som er konstant, men ligger få grader højere, formentlig ikke er skadelig for sædcellerne. Sædens kvalitet, målt som både motilitet og vitalitet, falder hurtigt ved opbevaringstemperatur lavere end 16-18 °C.

Konklusion

Ud fra resultater i afprøvningen ses nedsat motilitet og et fald i andelen af sædceller med intakt plasmamembran ved opbevaringstemperatur lavere end 16-18 °C og højere end 20-22 °C. Motiliteten og andelen af sædceller med intakt plasmamembran faldt forholdsvis kraftigt ved opbevaringstemperatur på 12-14 °C.

Referencer

[1]	Hansen, C. (2004): Regler for avl, drift og smittebeskyttelse for KS-stationer. Notat nr. 0425, Landsudvalget for Svin.
[2]	Hansen, C. (2004): Undersøgelse af effekten af opbevaringstid på ½, 1 og 2 timer for ejakulater inden fortynding – måling af vitalitet og motilitet. Meddelelse nr. 669, Landsudvalget for Svin.
[3]	Vesterager, L. (1993): Effekt af nedkølingsmetode og opbevaringstemperatur på motiliteten i ornesæd. Meddelelse nr. 266, Landsudvalget for Svin.
[4]	Hedeboe, A.M.; Olesen, T.; Madsen, M.T. (2003): Effekt af proces- og opbevaringstemperatur af Yorkshire- og Landracesæd på reproduktionsresultaterne. Erfaring nr. 0306, Landsudvalget for Svin.

Deltagere

Statistiker Mai Britt Friis Nielsen, Landsudvalget for Svin

Afprøvningen blev delvist finansieret af DanAvls KS-stationer

Afprøvning

Undersøgelsen er gennemført under afprøvning 782.

Opbevaringstemperatur for sædportioner ved 13, 17, 21 og 24 °C