Grise fra besætninger inficeret med Yersinia O:9 tester ofte positive i de nuværende Brucella tests. Afprøvning af en ny Brucella-test har indikeret, at den kan anvendes til at afkræfte Brucella mistanker forårsaget af Yersinia O:9 krydsreagenter.

En ny Brucella test, som er udviklet på DFVF i samarbejde med Landsudvalget for Svin, Danske Slagterier, er afprøvet i en avlsbesætning, som var smittet med Yersinia O:9, og som i længere tid havde haft brucellareagenter, uden at der var påvist Brucella.

Tohundrede ungdyr i alderen 4 til 7 måneder blev undersøgt. Dyrene blev undersøgt serologisk for Brucella vha. en Brucella test (SAT). Af de 200 undersøgte dyr reagerede 40 (20%) i SAT, hvorved de blev betegnet som brucellareagenter.

Én af brucellareagenterne døde af andre årsager. De øvrige 39 reagenter blev herefter testet med den nye Brucella IFN-γ test. I et tilfælde gav testen et ugyldigt resultat pga. et for højt baggrundsniveau, så resultatet blev kasseret, mens de øvrige 38 grise reagerede negativt i IFN-γ testen. Resultaterne bekræftede, at denne test ikke reagerer med krydsreagenter fra den serologiske test, og dermed tilsyneladende kan adskille dyr, der ikke er sandt inficeret med Brucella.

På anbefaling af DFVF blev der sideløbende udført en kutan test for Brucella på samtlige 39 dyr. Kutan testen bliver anvendt i kvæg og har erfaringsmæssigt en høj specificitet. Ingen af de 39 reagenter testede positivt i kutan testen.

På det foreliggende datagrundlag konkluderes, at IFN-γ testen formentlig er en meget specifik test til afklaring af serologiske Brucella-reagenter. En mulig implementering af testen i det danske avlssystem er dog betinget af en yderligere dokumentation af testens sensitivitet.

Baggrund

Orner fra avlsbesætninger, der indsættes på ornestationer, blodprøves bl.a. for Brucella. Desværre vil nogle orner, der er smittet med Yersiniaenterocolitica O:9, reagere positivt ved Brucella-testen. Dette har medført store problemer for de avlsbesætninger der, på baggrund af positive Brucella-reagenter, får indført offentlig tilsyn.

I samarbejde med Landsudvalget for Svin, Danske Slagterier blev der på Danmarks Fødevare- og Veterinærforskning (DFVF) i 2000 til 2002 udført eksperimentelle podninger af grise med Yersiniaenterocolitica O:9 og Brucella suis biovar 2, med henblik på at undersøge serologisk og cellulært immunrespons til undersøgelse af krydsreaktion mellem Yersinia O:9 og Brucella.

Undersøgelser af det cellulære immunrespons, specielt interferon-gamma (IFN-γ), har i eksperimentelt Yersinia O:9 inficerede grise vist negativt, eller i enkelte tilfælde, svagt respons over for Brucella-antigen. Syv af ni eksperimentelt Brucella-podede grise viste derimod et kraftigt positivt IFN-γ respons over for Brucella-antigen. Dette tyder på, at testen har en acceptabel sensitivitet (evne til at udpege smittede dyr som smittet). De resterende to Brucella-podede grise var hverken positive i serologiske tests, ved IFN-γ eller hud test (kutan test), eller ved bakteriologisk dyrkning efter aflivning. Det er således muligt, at infektionen ikke slog an ved podningen i de to dyr, og at det er årsagen til, at de ikke var Brucella-positive i nogle af de anvendte tests.

Med baggrund i de lovende resultater er det nødvendigt at gennemføre yderligere afprøvninger på et større grisemateriale. Afprøvning på grise smittet med Brucella (optimalt et klinisk udbrud fx i Sydeuropa) skal vurdere testens diagnostiske sensitivitet, mens afprøvning på grise, som er naturligt smittet med Yersinia O:9, skal vurdere IFN-γ testens evne til at afkræfte serologisk falsk positive reagenter som følge af krydsreaktion mellem Yersinia O:9 og Brucella.

Formålet med denne undersøgelse var derfor at afprøve en cellulær immunologisk test (IFN-γ) på grise fra Yersinia O:9-positive besætninger, som udviser positiv reaktion i serologiske Brucella-tests.

Materiale og metoder

I undersøgelsen indgik en avlsbesætning bestående af tre sites:

Site 1. Søer: polte indsættes ved løbealder
Site 2. Smågrisestald: 5-11 ugers fravænningsgrise + 2 sektioner med salgspolte (3-6 mdr.)
Site 3. Ungdyr: 3-8 mdr. salgspolte + eget tillæg og hjemmeafprøvning

Der er tidligere fundet serologisk positive reagenter overfor Brucella (krydsreagenter) fra 4½-6½ måneder gamle polte på site 3 samt i nogle få søer på site 1. Positive reagenter overfor Brucella er ikke fundet på site 2. Indtil videre er mistanken om Brucella afkræftet hver gang, mens Yersinia O:9 blev påvist bakteriologisk gentagne gange i besætningen.

I eksperimentelle forsøg på DFVF var der indikationer på, at IFN-γ testen har en meget høj specificitet, dvs. en meget god evne til at udpege ikke-smittede grise korrekt som ikke-smittet. Det blev derfor antaget, at testens specificitet var 100%, dvs. at der blandt Yersinia O:9-seropositive dyr ville være ingen eller meget få falsk-positive. Det kunne ud fra denne antagelse beregnes, at der skulle undersøges mellem 15 og 30 serologiske Brucella-krydsreagenter vha. IFN-γ testen, for at kunne give en foreløbig bestemmelse af dennes specificitet med tilstrækkelig sikkerhed (dvs. 95% konfidensgrænser på +/- 2,5%).

I avlsbesætningen varierede forekomsten af krydsreagenter blandt ungdyr på site 3 mellem 3 og 20%. Det betød, afhængig af forekomsten, at der skulle undersøges mellem 100 og 500 dyr i den serologiske Brucella-test, for at kunne finde 15 til 30 krydsreagenter. Det blev derfor besluttet, i første omgang at gennemføre en serologisk screening for Brucella-reagenter på mindst 200 ungdyr i besætningen.

I besætningen blev der udtaget blodprøver fra 200 individuelt mærkede grise fra site 3. Staldene er meget sektioneret, med 16-17 sektioner i alt, der regelmæssig tømmes og vaskes. Der fodres med hjemmeblandet foder, og der er spaltegulv og gyllesystem i alle stalde. Prøverne er udtaget fra en stikprøve af dyr cirka 4-7 måneder gamle. Eftersom der er 800 dyr i denne aldersgruppe på site 3, svarer det til cirka hvert femte dyr.

De 200 blodprøver er testet for Brucella ved en serologisk Brucella-test (serumagglutinations-test, SAT) på DFVF.

På serologiske reagenter for Brucella i SAT blev følgende undersøgelser udført én uge efter:

Udtagning af blodprøver til omprøvning i SAT og CF-test (komplement fikseringstest, som er en anden, ofte anvendt serologisk Brucella test)
Udtagning af blodprøver til IFN-γ test
Kutan-test

Kutan-testen anvendes i kvæg og har en kendt høj specificitet. Testen er mere arbejdskrævende end tests, der udføres på blod, og der er ikke mulighed for at inddrage positive eller negative kontroller. Kutan-testen bliver derfor sjældent anvendt til svin. Testen blev udført ved at sprøjte 0,1 ml Brucella antigen (Brucellergene®) ind i huden bag grisens venstre øre. Evt. reaktion (hævelse, rødme) blev aflæst efter 48 timer af en dyrlæge.

Resultater

Ud af de 200 testede ungdyr viste 40 (20%) sig at være serologisk positive i SAT overfor Brucella. En af grisene døde af andre årsager inden de opfølgende undersøgelser, hvorfor der indgik 39 grise i undersøgelsen.

Den gennemsnitlige alder på de 39 grise var 129 dage (min: 100 dage, max: 171 dage).

Af de 39 grise der testede serologisk positive overfor Brucella i første omgang, testede 36 (92%) også positive i anden omgang. Én gris fik et ugyldigt testresultat pga. et for højt baggrundsniveau i testen, hvorfor prøveresultatet blev kasseret. De øvrige 35 serologisk positive grise var alle negative i IFN-γ testen, hvilket indikerer, at grisene var krydsreagenter og dermed ikke inficeret med Brucella. På basis af disse resultater blev IFN-γ testens specificitet i denne afprøvning estimeret til 100% (et konfidensinterval kan ikke beregnes i dette tilfælde).

I kutan-testen var alle 39 grise negative for Brucella to døgn efter indsprøjtning.

Konklusion

Antallet af brucellareagenter var højere end anslået i styrkeberegningen, og afprøvningen gav et meget klart resultat. På det foreliggende datagrundlag konkluderes, at IFN-γ testen formentlig er en meget specifik test til afklaring af serologiske Brucella-reagenter.

Epilog

Implementering af IFN-γ testen forudsætter formentlig en bestemmelse af testens sensitivitet og specificitet, gerne under praktiske forhold, dvs. både i besætninger som er smittet med Brucella suis biovar 2 og i besætninger, der er smittet med Yersinia O:9. Internationale retningslinier (OIE guidelines) for evaluering af diagnostiske tests anbefaler validering i et relativt stort antal individer, og det kan blive vanskeligt at opfylde disse betingelser i Danmark.

Nuværende afprøvning indikerer, at IFN-γ testens specificitet er meget høj, så der er grundlag for yderligere afprøvning af testens specificitet. Data vedr. testens sensitivitet er p.t. meget begrænset, men podningsforsøg på DFVF tyder på, at den er sammenlignelig med de eksisterende serologiske Brucella-tests. Testens sensitivitet bør ideelt afprøves under praktiske forhold, dvs. i besætninger med klinisk udbrud af brucellose.

Ifølge DFVF skal testen godkendes af EU, for at den kan inkluderes i nuværende lovgivning. Godkendelsesproceduren kan tage op til flere år. Men en meget aktiv Brucella-ekspertgruppe under EU Kommissionen forventes at arbejde aktivt for at få den godkendt hurtigst muligt, idet problemstillingen med Brucella krydsreagenter også er relevant for en række andre EU lande.

Deltagere: Veterinærtekniker Søren Justesen, Landsudvalget for Svin, Danske Slagterier.

Ny Brucella/Yersinia O:9 diagnostik