I perioden juni 2002 – september 2003 blev der ugentligt udtaget færdigfortyndede sæddoser af produktionen på samtlige DanAvls KS-stationer til mikrobiologisk undersøgelse for indhold af bakterier og svampe (kim).

I perioden juni 2002 – september 2003 blev der ugentligt udtaget færdigfortyndede sæddoser af produktionen på samtlige DanAvls KS-stationer til mikrobiologisk undersøgelse for indhold af bakterier og svampe (kim). Slanger til tappe/fylde-anlæg (påfyldningsmaskine til sædposer) blev også undersøgt for kim.

Der indgik 12 KS-stationer i afprøvningen. I alt blev der undersøgt 1.451 færdigfortyndede sæddoser og 145 slanger til tappe/fylde-anlæg. Cirka 7 procent af de undersøgte sæddoser var forurenede med et kimtal på over 300 CFU (CFU s. Colony Forming Units s. kolonidannende enheder), og samme procentsats af slanger var forurenede med et kimtal på over 50 CFU. Ved fund af forurenede sæddoser eller slanger blev tilstedeværende kim identificeret.

De fundne bakterier kunne efter identifikation opdeles i hidhørende fra enten stald- eller laboratoriemiljøet. Aviær Bordetella og Alcaligenes faecalis, som var det primære fund i sæddoser, stammer fra staldmiljøet, mens Aeromonas spp., Pseudomonas og skimmelsvamp, fundet i forurenede slanger, stammer fra laboratoriemiljøet. De isolerede bakterier var stort set alle inaktive ved dyrkning og de må derfor forventes ikke at have været sygdomsfremkaldende.

Overordnet viste resultaterne, at når en KS-station blev gjort opmærksom på forurening, blev der gjort hygiejniske tiltag, således at efterfølgende sædprøver ikke gav positive resultater.

Fremover vil der fra samtlige DanAvls KS-stationer rutinemæssigt hver uge blive indsendt sæddoser til mikrobiologisk kontrol hos Fødevaredirektoratet. Slanger til tappe/fylde-anlæg indsendes alene efter uanmeldt KS-stationsbesøg eller på konkret mistanke.

Baggrund

Siden marts 2001 har DanAvls KS-stationer anvendt antibiotikakombinationen gentamycin og amoxicillin som tilsætning ved fortynding af ornesæd [1]. Antibiotikakombinationen blev valgt, da de to stoffer har en synergistisk effekt, hvilket vil sige, at de virker mere effektivt sammen end alene, hvorved risikoen for udvikling af resistens minimeres.

Samtidig blev antibiotikakombinationen valgt, da denne også er effektiv overfor Salmonella typhimurium, DT104. Gentamycin alene har igennem mange år været anvendt på udenlandske KS-stationer og herhjemme af besætningsejere, som laver intern KS. Nyere udenlandske undersøgelser viser imidlertid en øget resistens overfor gentamycin hos de bakterier som isoleres fra ornesæd [2]. En øget resistens overfor det i ornesædsfortynderen tilsatte antibiotikum kan bevirke en øget vækst af bakterier i den færdigfortyndede sæddose og dermed en øget risiko for infektion af soen ved inseminering, samt at tilstedeværende bakterier kan ødelægge sædcellernes befrugtningsevne, begge faktorer som kan påvirke reproduktionsresultaterne negativt. Derfor er det blevet besluttet at indføre et hygiejnisk kontrolprogram af færdigfortyndede sæddoser produceret på DanAvls KS-stationer.

Formålet med afprøvningen var at indkøre et kontrolprogram bestående af en mikrobiologisk undersøgelse af færdigfortyndede sæddoser for indhold af kim, samt overvåge eventuelt udvikling af resistens mod den anvendte antibiotikakombination. Endvidere at udvikle et mikrobiologisk beredskab, således at årsagen til forurenede sæddoser kan blive afdækket og fjernet.

Afprøvningen blev gennemført med delvis økonomisk støtte fra DanAvls KS-stationer.

Materiale og metode

I perioden juni 2002 – september 2003 blev der ugentligt udtaget færdigfortyndede sæddoser af produktionen på samtlige DanAvls KS-stationer. Sæddoserne blev udtaget tilfældigt af personalet på den pågældende KS-station, dog således at de udtagne prøver repræsenterede første, midterste og sidste del af produktionen den pågældende dag.

I første del af afprøvningsperioden blev der udtaget tre færdigfortyndede sæddoser pr. uge pr. KS-station, mens dette blev reduceret til to færdigfortyndede sæddoser i sidste del af afprøvnings-perioden, alene repræsenterende første og sidste del af produktionen.

Prøverne blev udtaget hver søndag og opbevaret ved 16-18°C indtil afsendelse med posten til et laboratorium førstkommende tirsdag. På laboratoriet blev prøverne umiddelbart efter modtagelse onsdag morgen undersøgt for kim. Dette svarede til at prøverne blev undersøgt cirka 72 timer efter opsamling.

Slanger til tappe/fylde-anlæg blev også undersøgt for kim. Slangerne blev udtaget tilfældigt henover tid, men undersøgelse af slanger fandt især sted dersom positive sæddoser var blevet fundet forinden. Endvidere blev der undersøgt forskellige laboratorieremedier og luftprøver på en enkelt KS-station efter fund af positive sæddoser, således at mere specifikke forureningskilder kunne verificeres.

Undersøgelsen for kimtal blev i alle tilfælde udført efter standardforskriften: ”Vandundersøgelse. Bestemmelse af antal mikroorganismer i gærekstraktagar ved 22 og 36°C. Dybdeudsæd” (DS/EN ISO 6222). Undersøgelsen blev udført hos Fødevaredirektoratet, Fødevareregion Vejle, 7100 Vejle.

For de færdigfortyndede sæddoser blev anvendt en grænseværdi på over 300 CFU pr. ml færdigfortyndet sæd som værende forurenede og over 50 CFU pr. ml skyllevæske for slanger til tappe/fylde-anlæg som værende forurenede. Grænseværdierne blev fastsat i samarbejde med Fødevaredirektoratet.

Resultater og diskussion

Der indgik 12 KS-stationer i afprøvningen. Under afprøvningsperioden blev Hatting-KS, Ådum afdelingen og Ornestationen Mors 2 inddraget, da de i perioden åbnede som nye KS-stationer. Samtidig stoppede Hatting-KS, Ansager afdelingen med at indsende prøver, da KS-stationen skiftede status til isolationsstald.

I alt blev der undersøgt 1.451 færdigfortyndede sæddoser og 145 slanger til tappe/fylde-anlæg. Det gennemsnitlige kimtal for de færdigfortyndede sæddoser og slanger er i tabel 1 sammenlignet med historiske data for fund af kim.

Tabel 1. Kimtal i færdigfortyndede sæddoser og slanger til tappe/fylde-anlæg. Gennemsnit for 12 KS-stationer, samt historiske data med angivelse af anvendte antibiotikum

Antal (prøveperiode)	Sæddoser	Slanger	Antibiotika til ornesædsfortynderen
Total, stk. (10.06.02-03.09.03)	1.451	145	Gentamycin/Amoxicillin
Positive, stk. (10.06.02-03.09.03)	105	11	Gentamycin/Amoxicillin
Positive, pct. (10.06.02-03.09.03)	7,2	7,6	Gentamycin/Amoxicillin
Positive, pct. (1997-2001)	2,5	100	EU-cocktail ¹⁾
Positive, pct. (1996)	3,2	- ²⁾	EU-cocktail
Positive, pct. (1996)	11,7	-	Neomycin
Positive, pct. (1988)	72,0 ³⁾	-	Neomycin

1) EU-cocktailen bestod af streptomycin, penicillin, lincomycin og spectinomycin
2) Ingen slanger indsendt til undersøgelse
3) Grænseværdien for om en prøve var positiv var < 1 CFU pr. ml færdigfortyndet sæd

Tallene for afprøvningsperioden juni 2002 – september 2003 viser, at cirka hver 14. indsendte sædprøve og slange til tappe/fylde-anlæg var forurenede. For de færdigfortyndede sæddoser var dette lavere end for data opgjort i år 1988 og 1996 (ved anvendelse af neomycin), men højere end for opgørelserne i år 1996 (ved anvendelse af EU-cocktailen) og i perioden 1997 – 2001.

For slanger er positive fund reduceret markant sammenlignet med den eneste anden udførte opgørelse fra perioden 1997 - 2001.

Positive fund fordelt på KS-station i afprøvningsperioden er angivet i tabel 2.

Tallene i tabel 2 skal læses således, at først opgives antal enheder, som er undersøgt med antal forurenede enheder i parentes. Nedenunder disse tal angives antal positive fund i procent, efterfulgt af hvornår den sidste positive enhed blev fundet.

Ud af 12 KS-stationer bidrog 11 KS-stationer med positive prøver. Overordnet kan tallene pr. KS-station gøres op som følger: Hatting-KS, Skjern afdelingen, går helt fri hvad angår positive prøver. Herefter ligger Hatting-KS, Ådum, Viborg og Aalborg afdelingerne, samt Ornestationen Mors væsentligt lavere end gennemsnittet, hvad angår positive fund. Hatting-KS, Ringsted, Ansager og Horsens afdelingerne, ligger omkring gennemsnittet, mens Ornestationen Mors 2 , Vestsjællands Ornestation samt Hatting-KS, Odense afdelingen og Ministergården, ligger væsentlig over gennemsnittet.

Hertil skal nævnes, at positive prøver fra år 2003 af afprøvningsperioden alene er fundet i sæddoser fra Hatting-KS, Ådum og Horsens afdelingen og Ministergården, samt fra Ornestationen Mors 2 og Vestsjællands Ornestation.

Tabel 2. Kimtal i færdigfortyndede sæddoser og slanger til tappe/fylde-anlæg, fordelt på KS-station

KS-station (prøveperiode)	Sæddoser, stk. (positive) (pct.) (sidste positive fund)	Slanger, stk. (positive) (pct.) (sidste positive fund)
Hatting-KS, Ådum afd. (08.01.03 – 03.09.03)	89 (2) (2,2) (august 2003)	2 (0) (0,0) (-)
Hatting-KS, Ringsted afd. (25.06.02 – 03.09.03)	140 (12) (8,6) (december 2002)	11 (0) (0,0) (-)
Hatting-KS, Ansager afd. (11.06.02 – 30.10.02)	57 (4) (7,0) (oktober 2002)	8 (0) (0,0) (-)
Hatting-KS, Skjern afd. (11.06.02 – 06.08.03)	154 (0) (0,0) (-)	7 (0) (0,0) (-)
Ornestationen Mors (11.06.02 – 06.08.03)	116 (4) (3,4) (november 2002)	4 (0) (0,0) (-)
Ornestationen Mors 2 (30.07.02 – 27.05.03)	40 (5) (12,5) (marts 2003)	- ¹⁾
Vestsjællands Ornestation (18.06.02 – 05.08.03)	95 (15) (15,8) (juni 2003)	2 (0) (0,0) (-)
Hatting-KS, Horsens afd. (18.06.02 – 03.09.03)	153 (11) (7,2) (august 2003)	7 (3) (42,9) (oktober 2002)
Hatting-KS, Odense afd. (10.06.02 – 03.09.03)	144 (23) (16,0) (september 2002)	15 (0) (0,0) (-)
Hatting-KS, Ministergården (17.06.02 – 03.09.03)	146 (20) (13,7) (september 2003)	16 (0) (0,0) (-)
Hatting-KS, Viborg afd. (17.06.02 – 03.09.03)	172 (4) (2,3) (september 2002)	46 (7) (15,2) (september 2002)
Hatting-KS, Aalborg afd. (18.06.02 – 03.09.03)	145 (5) (3,4) (december 2002)	27 (1) (3,7) (december 2002)

1) Ingen slanger indsendt til undersøgelse

Ved overskridelse af de anvendte grænseværdier for henholdsvis færdigfortyndede sæddoser (> 300 CFU pr. ml færdigfortyndet sæd) og slanger til tappe/fylde-anlæg (> 50 CFU pr. ml skyllevæske) blev de fundne kim identificeret. Resultaterne heraf er angivet i tabel 3.

Det viste sig at være de samme bakterietyper, der blev isoleret, også KS-stationerne imellem. De fundne bakterier var stort set alle inaktive og dannede ofte små og langsomt voksende kolonier på grund af tilstedeværende antibiotika, således at en rendyrkning i op til fem dage ikke var usædvanlig i laboratoriet. De tilstedeværende bakterier må derfor forventes ikke at være sygdomsfremkaldende. Uanset dette skal fundne bakterier karakteriseres som værende resistente overfor antibiotikakombinationen amoxicillin og gentamycin.

Alcaligenes faecalis er årsag til sygdommen rhinotracheitis (luftvejssygdom) hos kalkuner. Bakterien er yderst resistent for vind og vejr, men følsom for desinfektion. Den spredes med gnavere og fugle. Aviær Bordetella (CDC, type IV) er tæt relateret til Alcaligenes faecalis. Faktisk var de tidligere karakteriseret som samme bakterie. Tages de to bakterier under ét, blev bakterien fundet i sæddoser fra samtlige KS-stationer, som havde leveret forurenede sæddoser, med undtagelse af Hatting-KS, Ådum og Ansager afdelingerne. Bakterien blev dog ikke fundet ved nøjere mikrobiologisk undersøgelse af et laboratorium på een KS-station, så bakterien må formodes at komme som en kontinuerlig forurening fra stalden. Enterobacter cloacae og Escherichia coli er tarmbakterier fra grise eller mennesker. Arnestedet for disse bakterier er derfor i stalden. Alcaligenes spp., Ralstonia og de resterende fundne bakterier tilføres primært fra forurenet vand og fugtige områder. Det skal dog nævnes, at Pseudomonas putida har en forkærlighed for PVC-plast. I en enkelt slange blev der fundet Chryseobacterium meningosepticum, som er associeret med blodforgiftning og meningitis hos fostre.

Tabel 3. Kimtal i færdigfortyndede sæddoser og slanger til tappe/fylde-anlæg, fordelt på KS-station med positive fund. Identifikation af fundne bakterier

KS-station	Sæddoser, stk. (positive, stk.)	Identifikation	Slanger, stk. (positive, stk.)	Identifikation
Hatting-KS, Ådum afd.	89 (2)	Alcaligenes xylosoxidans	2 (0)	-
Hatting-KS, Ringsted afd.	140 (12)	Aviær Bordetella Alcaligenes faecalis	11 (0)	-
Hatting-KS, Ansager afd.	57 (4)	Alcaligenes xylosoxidans	8 (0)	-
Ornestationen Mors	116 (4)	Alcaligenes xylosoxidans Alcaligenes faecalis	4 (0)	-
Ornestationen Mors 2	40 (5)	Alcaligenes xylosoxidans Alcaligenes faecalis	-	-
Vestsjællands Ornestation	95 (15)	Alcaligenes xylosoxidans Alcaligenes faecalis Ralstonia pickettii	2 (0)	-
Hatting-KS, Horsens afd.	153 (11)	Aviær Bordetella Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas putida Ralstonia pickettii Agrobacteriacea radiobacter Spheromonas paucimobilis	7 (3)	Aeromonas spp.
Hatting-KS, Odense afd.	144 (23)	Aviær Bordetella Ralstonia pickettii Alcaligenes xylosoxidans Comanmonas testosteronida	15 (0)	-
Hatting-KS Ministergården	146 (20)	Aviær Bordetella Alcaligenes faecalis Alcaligenes xylosoxidans Escheriachia coli	16 (0)	-
Hatting-KS, Viborg afd.	172 (4)	Aviær Bordetella Alcaligenes faecalis Enterobacter cloacae Alcaligenes xylosoxidans Pseudomonas putida	46 (7)	Pseudomonas putida Chryseobacterium meningosepticum Skimmelsvamp
Hatting-KS, Aalborg afd.	145 (5)	Aviær Bordetella Alcaligenes faecalis	27 (1)	Acinetobacter iwoffii

De fundne kim kunne efter identifikation opdeles i hidhørende fra enten stald- eller laboratoriemiljøet. Aviær Bordetella og Alcaligenes faecalis, som var det primære fund i sæddoser, stammer fra staldmiljøet, mens Aeromonas spp., Pseudomonas og skimmelsvamp, fundet i forurenede slanger, stammer fra laboratoriemiljøet. Førstnævnte to bakterier spredes med fugle og gnavere, hvorfor en øget bekæmpelse i stalden, specielt mod gnavere, bør iværksættes. De nævnte laboratoriespecifikke bakterier bør bekæmpes ved en øget hygiejne i laboratorierne.

Overordnet må det konkluderes, at de fundne bakterier ikke udgjorde nogen sundhedsmæssig risiko ved introduktion i børen på søer, og at deres tilstedeværelse alene kunne have haft en negativ påvirkning af sædcellerne.

Der blev ikke vist nogen sammenhæng mellem positive fund af kim i sæddoser og hvornår i produktionen prøven blev udtaget (først, midt og sidst), da der blev fundet lige mange prøver i hver gruppe. Derimod var det ofte således, at var en sæddose forurenet, så var samtlige udtagne sæddoser samme dag også forurenede. Der var ingen effekt af årstid på antal af forurenede sæddoser og heller ingen sammenhæng mellem fund af forurenede slanger og forurenede sæddoser.

Ved nøjere gennemgang af mulige forurenede områder i et laboratorium på en KS-station, blev følgende konkluderet:

Gaze til opsamling af råsæd. Denne var yderst forurenet. Gaze i ubrudt pakning gav kimtal fra 5–160 CFU pr. gram, mens gaze fra åbnet pakning opbevaret i forrum gav kimtal fra 40–4.800 CFU pr. gram. Gazen er altså ikke steril, når denne modtages fra leverandør. Løsningsforslag: Anvendelse af steril gaze eller at gazen ompakkes med en mængde svarende til én dags forbrug, således at der ikke ophobes kim i hele pakken.

Svaberprøver af slanger til initial- og færdigfortynding indeholdt et højt antal kim. Ved ophængning løst i laboratoriet kunne denne forurening have fundet sted, eller alternativt havde slangerne ikke været rengjort efter reglerne (Regler for Avl, Drift og Smittebeskyttelse på KS-stationer, april 2003). Løsningsforslag: Anvendelse af handsker ved håndtering af slanger, at slanger opbevares et andet sted end løst i laboratoriet, og at opvaskemaskine, dersom en sådan anvendes, undersøges med hensyn til vasketemperatur.

Dunke, der har indeholdt fortynder, og som har stået åbne i laboratoriet gennem længere tid, indeholdt et højt antal kim. Løsningsforslag: Anvendelse af dunke til sædblandinger bør alene ske efter rengøring i henhold til reglerne [3].

Destilleret vand i dispenseren til antibiotikafortynding indeholdt et højt antal kim. Løsningsforslag: Antibiotikafortynding bør ske ved anvendelse af engangspipetter, og således at der fremstilles antibiotika til en hel dagsproduktion ad gangen.

Fluer, især kloakfluer, bør bekæmpes i laboratoriet. Dette kan gøres ved at rense og checke vandlås og afløb til vask i laboratoriet, samt ved lokal fluebekæmpelse.

Overordnet viste resultaterne, at når en KS-station blev gjort opmærksom på forurening, så blev der gjort hygiejniske tiltag, således at efterfølgende sædprøver ikke gav positive resultater. Dette har bevirket, at der for året 2003 alene har været leveret positive sæddoser fra fem KS-stationer.

Fremover vil der fra samtlige DanAvls KS-stationer ugentligt blive indsendt sæddoser til mikrobiologisk undersøgelse. Slanger til tappe/fylde-anlæg indsendes alene efter uanmeldt KS-stations besøg eller på konkret mistanke.

Referencer

[1]	Meddelelse nr. 496, 2000: Ny antibiotikakombination som tilsætning til ornesæd. Landsudvalget for Svin
[2]	Althouse, G.C., C.E. Kuster, S.G. Clark & R.M. Weisiger, 2000: Field investigations of bacterial contaminants and their effects on extended procine semen. Theriogenology 53, 1167-1176
[3]	Regler for Avl, Drift og Smittebeskyttelse på KS-stationer, april 2003. Landsudvalget for Svin

Mikrobiologisk undersøgelse af færdigfortyndede sæddoser fra DanAvls KS-stationer