Ved anvendelse af NucleoCounter SP-100 ved produktion af sæddoser blev opnået et cirka dobbelt så godt resultat som ved anvendelse af fotometeret Corning 254.

På DanAvls KS-stationer anvendes fotometri til bestemmelse af sædkoncentrationen i råsæd. Målinger med fotometri danner således i dag grundlag for fortynding af sæd til sæddoser. Tidligere afprøvninger har vist, at NucleoCounter SP-100 (SP-100) er cirka dobbelt så god som fotometri til koncentrationsbestemmelse af ornesæd. SP-100 blev i denne afprøvning anvendt til koncentrationsbestemmelse af råsæd i forbindelse med fremstilling af sæddoser, og dannede dermed grundlag for fortynding af råsæd til færdige sæddoser. Tilfældige sæddoser blev efterfølgende udtaget til flowcytometrisk analyse af mængden af sædceller pr. sæddose. Endvidere blev resultaterne sammenlignet med analyser af tilfældige sæddoser indsendt fra en anden KS-station, der anvendte fotometer til koncentrationsbestemmelse.

Resultaterne viste, at indholdet af motile sædceller i sæddoserne i gennemsnit var 2,11 mia., hvor den nedre 5 pct. percentil var 1,84. Dette svarer til, at 95 pct. af alle producerede sæddoser indeholdt mere end 1,84 mia., hvilket er 12,8 pct. lavere end det gennemsnitlige indhold. Ved anvendelse af fotometer (Corning 254) sås samme gennemsnitlige indhold, men den nedre 5 pct. percentil var 1,53, - godt 27 pct. mindre end det gennemsnitlige indhold.

Ved anvendelse af SP-100 til koncentrationsbestemmelse af råsæd ved daglig produktion af sæddoser blev der opnået en betragtelig reduktion af forskellen mellem det ønskede indhold af sædceller og det aktuelle indhold i den færdige sæddose. SP-100 var således cirka dobbelt så god som anvendelse af fotometer, når der alene kigges på den nedre grænse for hvad sæddoserne indeholdt.

Baggrund

I forbindelse med produktion af sæddoser ønskes et ensartet produkt med hensyn til indhold af motile sædceller. Målet er dels at sikre et indhold af sædceller der sikrer, at søerne bliver drægtige, dels at sikre, at der kan fremstilles flest mulige sæddoser. Indeholder sæddoserne for mange sædceller, kunne der potentielt produceres flere doser, og indeholder doserne får få sædceller, kan det gå ud over reproduktionsresultaterne.

Et kvalitetskrav i forbindelse med produktion af sæddoser kunne være en nedre grænse for indholdet af sædceller. Ved meget ensartede sæddoser vil det være muligt at gå tættere på denne grænse og samtidig overholde kvalitetskravet. Ved meget ensartet produktion undgår man således en produktion, hvor sæddoserne indeholder for mange sædceller. Derved optimeres produktionen og det bliver muligt gennemsnitligt at producere flere sæddoser pr. sædopsamling.

Et centralt punkt ved opnåelse af ensartede sæddoser er en nøjagtig og repeterbar koncentrationsbestemmelse af råsæd. Der har hidtil ikke været anvendelige instrumenter som opfylder netop dette krav. En tidligere afprøvning har imidlertid vist lovende resultater ved anvendelse af NucleoCounter SP-100 til koncentrationsbestemmelse af råsæd [1].

Formålet med denne afprøvning var at undersøge, om NucleoCounter SP-100 var anvendelig til rutineanalyser af råsæd ved anvendelse af instrumentet i daglig produktion af sæddoser. Endvidere blev resultater fra en anden ornestation, hvor fotometri anvendtes, sammenlignet med resultaterne ved anvendelse af SP-100.

Materiale og metode

Igennem en periode på to måneder skulle NucleoCounter SP-100 (SP-100) erstatte fotometeret til måling af sædkoncentration. SP-100 blev medio oktober 2003 introduceret til i alt fire forskellige medarbejdere på ornestationen. Igennem en prøveperiode på to måneder blev instrumentet kun betjent af de fire personer. SP-100 blev anvendt til koncentrationsbestemmelse af alle opsamlede ejakulater i denne periode. I perioden blev der udtaget en tilfældig dose fra hver af i alt 179 ejakulater. De udtagne sæddoser blev vejet og analyseret med flowcytometri for at bestemme antal sædceller i dosen.

Endvidere er resultater fra en løbende flowcytometrisk kontrol af sæddoser produceret på en anden ornestationer inkluderet. Der blev udvalgt den ornestation med mest stabilt indhold af sædceller i sæddoserne. Sæddoserne blev produceret ved anvendelse af fotometri til koncentrationsbestemmelse af råsæd, og er udført i henhold til ”Regler for avl, drift og smittebeskyttelse på KS-stationer” [2]. Fortyndingen af sæden til sæddoser blev beregnet ud fra ovennævnte koncentrationsbestemmelse. En stikprøve af tilfældigt udvalgte sæddoser fra produktionen blev sendt til laboratoriet til flowcytometrisk analyse. Disse analyser blev udført som enkeltbestemmelser.

Koncentrationsbestemmelse med SP-100

Efter sæden var tappet blev den omhældt til en plastdunk og leveret til laboratoriet. Sæden blev derefter blandet, og motilitet og koncentration blev bestemt. Bestemmelse af sædkoncentrationen med SP-100 blev udført i henhold til vejledning fra producenten [3]. Der blev udtaget 50 µl råsæd med en Finnpippette (Labsystems, Helsinki, Finland). De 50 µl blev afsat på bunden af en prøvekop (Chemometec A/S, Allerød, Danmark). Derefter blev 10,0 ml Reagent S-100 (Chemometec A/S) tilsat med en Dispensette III (Brand, Wertheim, Tyskland). Tilsætningen af Reagent S-100 sikrede en tilstrækkelig opblanding. Efterfølgende blev en prøve af den fortyndede sæd udtaget med NucleoCassette SP-1 (Chemometec A/S) og analyseret i instrumentet. Bestemmelsen af koncentrationen tilsammen med volumen af ejakulatet og motiliteten dannede grundlag for fortynding af sæden. Sæden blev efterfølgende initialfortyndet til 2,0 mia. motile sædceller pr. 25 ml. Ved fyldning af sæd på doser blev tilsat 25 ml initialfortyndet sæd og 56 ml fortynder. Det var således tilsigtet, at alle sæddoser skulle indeholde 2,0 mia. motile sædceller i 81 ml.

Analyse af sæddoser

Sæddoser udtaget til flowcytometrisk analyse blev vejet og efterfølgende blandet grundigt inden koncentrationen blev bestemt efter gældende vejledning [4]. Indledningsvist blev 50 µl sæd udtaget med FACSCount pipette (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Den udtagne prøve blev fortyndet 1:10 i EDTA-ornesædsfortynder i et 2,0 ml PP-rør (Hounisen, Risskov, Danmark). Efter grundig blanding af den fortyndede sædprøve blev 50 µl udtaget og tilsat et analyserør (BD Biosciences). Analyserøret blev opbevaret ved stuetemperatur i fem minutter til indfarvning inden analyse med FACSCount AF System (BD Biosciences).

Den flowcytometriske analyse af doser blev udført som dobbeltbestemmelse.

Statistisk analyse

Antal motile sædceller i sæddoserne blev analyseret deskriptivt med univariatanalyse. Variationen mellem dobbeltbestemmelse af koncentrationen blev evalueret via variationskoefficienten. Variansen og middelværdien blev estimeret ved variansanalyse med hvert ejakulat som tilfældig effekt - en parvis sammenligning af dobbelbestemmelserne.

For gruppen af sæddoser produceret ved anvendelse af SP-100 var data ikke normalfordelt. Fordelingen var højreskæv, idet en del af sæddoserne indeholdt for mange sædceller. For at opnå normalfordeling og dermed et korrekt estimat for standardafvigelsen på middelværdien blev værdier over 2,6 mia. slettet ved beregning af standardafvigelse for gennemsnittet.

Resultater og diskussion

Anvendelse af SP-100 til koncentrationsbestemmelse

Det tilsigtede indhold af motile sædceller pr. sæddose var 2,0 mia. I gennemsnit indeholdt sæddoserne 2,14 mia. motile sædceller pr. dose, hvilket var 7 pct. mere end forventet. Der var en tendens til, at sæddoser i større udstrækning indeholdt for mange end for få sædceller. Årsagen kan skyldes prøveudtagning af råsæd til koncentrationsbestemmelsen med SP-100. Opblandes råsæden ikke grundigt før prøven udtages, kan sædceller være bundfældet og vil derfor ligge på bunden af sæddunken. Ved prøveudtagningen udtages 50 µl råsæd fra væskeoverfladen og koncentrationen kan derfor i disse tilfælde underestimeres. En underestimering af råsædskoncentrationen vil medføre, at sæddoser indeholder for mange sædceller.

Ved produktion af sæddoser bliver der først gennemført en initialfortynding, hvor ejakulatet fortyndes til 2,0 mia. motile sædceller pr. 25 ml. Ved fremstiling af sæddoser tilsættes der først 56 ml fortynder og efterfølgende 25 ml initialfortyndet sæd. Opstår der en fejl ved tilsætning af ren fortynder betyder det intet for indholdet af sædceller pr. dose. Er fejlen derimod sket ved tilsætning af initialfortyndet sæd, medfører fejlen, at sæddosen indeholder et forkert antal sædceller. Der var en tendens til, at sæddoser der indeholdte et afvigende volumen i forhold til størsteparten af sæddoser også indeholdte et forkert antal sædceller.

Variationskoefficienten for dobbeltbestemmelser af indholdet i sæddoserne var 3,3 pct., hvilket svarer til resultater opnået ved tidligere undersøgelser [1].

Figur 1. Antal sædceller (i mia.) pr. sæddose. Sæddoserne blev produceret ved anvendelse af SP-100

Figur 2. Antal sædceller (i mia.) pr. sæddose. Sæddoserne blev produceret ved anvendelse af fotometer

Resultater for løbende flowcytometrisk kontrol med sæddoser fra andre KS-stationer

Ved undersøgelse af sæddoser produceret på andre ornestationer blev der fundet væsentlig større forskel mellem producerede doser end ved anvendelse af SP-100 (figur 1 og 2). Dette fremgår tydeligt ved udregning af det gennemsnitlige indhold, sammenholdt med den nedre konfidensgrænse for indholdet af sædceller i sæddoserne (tabel 1).

Tabel 1. Indhold af sædceller i sæddoser fremstillet ved brug af henholdsvis SP-100 og fotometer

	Resultater for indhold I sæddoser
Instrument til bestemmelse af råsædskoncentrationen	Antal prøver	Gennemsnit	Median^*	Standard- afvigelse	Nedre 5 pct. percentil
SP-100	179	2,14 mia.	2,11 mia.	0,17^**	1,84 mia.
Fotometer	157	2,10 mia.	2,10 mia.	0,36	1,53 mia.

*	Medianen er den midterste værdi af alle koncentrationsmålingerne. Hvis medianen er lavere end gennemsnittet, er der en overvægt af doser med for højt indhold.
**	Kun værdier under 2,6 mia. blev medregnet, idet fordelingen af tallene var skæv og derfor gav en urealistisk høj standardafvigelse. Denne skæve fordeling sås ikke ved anvendelsen af fotometer.

Ved tidligere afprøvninger er vist, at SP-100 er cirka dobbelt så god til bestemmelse af sædkoncentration i forhold til fotometri [1]. I nærværende afprøvning blev vist, at anvendelse af SP-100 i produktionen under praktiske forhold medførte mindre forskel i antal sædceller mellem de producerede sæddoser.

Igennem længere tid har der været gennemført en løbende flowcytometrisk kontrol af sæddoser fra KS-stationerne. Denne kontrol har vist forskelle i samme størrelsesorden som der blev set i denne afprøvning, også inden for samme KS-station. Data fra den løbende kontrol bygger på en længere periode end de to måneder afprøvningen varede.

Konklusion

Resultaterne viste, at indholdet af sædceller i sæddoserne gennemsnitligt var 2,11 mia., hvor den nedre 5 pct. percentil var 1,84. Dette svarer til, at 95 pct. af alle producerede sæddoser indeholdt mere end 1,84 mia., hvilket er 12,8 pct. lavere end det gennemsnitlige indhold. Ved anvendelse af fotometer sås samme gennemsnitlige indhold, men den nedre 5 pct. percentil var 1,53 - godt 27 pct. mindre end det gennemsnitlige indhold.

Ved anvendelse af SP-100 til koncentrationsbestemmelse af råsæd ved daglig produktion af sæddoser reduceres forskellen mellem det ønskede indhold og indholdet i den dose med færrest antal sædceller betragteligt. Dette er i forhold til nuværende metode, hvor fotometeret Corning 254 anvendes.

Referencer

[1]	Hansen, C; Hedeboe, A.M.: (2003): Test af NucleoCounter SP100, MiniTüb SDM5 og Corning 254 til koncentrationsbestemmelse af råsæd. Meddelelse nr. 613, Landsudvalget for Svin.
[2]	Hansen, C.: (2004): Regler for avl, drift og smittebeskyttelse på KS-stationer. Notat nr. 0413, Landsudvalget for Svin.
[3]	Chemometec: (2003): NucleoCounter ^® SP-100 Users Guide. Cell Counter for Boars Semen. Manual no. 991-0100, September 10, 2003. ChemoMetec A/S, Allerød, Denmark.
[4]	Christensen, P.: (2003): Den korte vejledning i anvendelse af flowcytometri til undersøgelse af ornesæd. Den Kgl. Veterinær- og Landbohøjskole, Frederiksberg, Danmark.

Deltagere: Hatting-KS, Ringsted afdeling, Køgevej 103, 4100 Ringsted
Statistiker: Mai Britt Nielsen, Landsudvalget for Svin
Afprøvning: 765

Implementering af NucleoCounter SP-100 på ornestationen Hatting-KS, Ringsted afdeling