Der blev fundet en statistisk sikker forskel mellem ornerne i antal befrugtede æg og antal sædceller der omgav hvert æg.

Undersøgelsen beskriver to metoder til bestemmelse af ornesædens kvalitet. Frugtbarheden af to orner, med målbar god - hhv. dårlig sædkvalitet er undersøgt ved bestemmelse af antal befrugtede æg på to grupper af 6 dage drægtige LYDH-gylte.

Der blev fundet en statistisk sikker forskel mellem ornerne i antal befrugtede æg og antal sædceller der omgav hvert æg.

Baggrund

Kuldstørrelsen varierer efter hver KS-orne. Denne variation kan ikke genfindes ved vurderingen af sædkvaliteten på KS-stationerne, det skyldes hovedsageligt, at sædkvalitetsvurderingen har været påvirket af den enkelte sædbedømmer, og dermed ikke har været tilstrækkelig objektiv.

Nye sædanalysemetoder har gjort det muligt at beskrive en sammenhæng mellem sædkvaliteten og frugtbarheden hos tyre- og ornesæd.

I denne undersøgelse søges beskrevet en sammenhæng mellem objektiv bestemt sædkvalitet og frugtbarheden af to orner med forskellig frugtbarhed.

Gennemførelse

Orner defineres med dårlig sædkvalitet når de har under 70 pct. bevægelige sædceller eller mere end 30 pct. defekte sædceller. Det formodes at sædens frugtbarhed er nedsat. Modsat forventes det, at orner med bedre sædkvalitet har bedre frugtbarhedsresultater.

Til undersøgelsen blev der udvalgt to duroc-orner fra ornestationen Hatting Horsens.De to orner havde ekstrem forskellig sædkvalitet ved visuel bedømmelse i fasekontrast mikroskop.

Orne nr. D5618 God sædkvalitet med et konstant sædbillede over sidste kvartal inden undersøgelsen. Motiliteten var 90 pct. og koncentrationen i ejakulaterne 400.000-500.000 sædceller pr. ml. I samme tidsrum var der ingen kassationer af ejakulater som følge af abnorme sædceller.

Orne nr. D5271 Dårlig sædkvalitet med et dårligt sædbillede over en længere periode. Motiliteten vurderedes til 50 pct. eller derunder, og dette sammen med defekten halekrøller og distaldråber, førte til kassation af sæden.

Der blev fra hver af de to orner opsamlet èt ejakulat. Heraf blev der udtaget en prøve til sædkvalitetsanalyse, hvorefter resten af ejakulatet blev videreforarbejdet til inseminationsdoser à 2,0 mia. sædceller.

På "Grønhøj" blev der sammensat et hold på 48 LYDH-sogrise. Sopoltene blev fodret restriktivt til en vægt på ca. 120 kg, hvorefter deres første spontane brunst blev fremprovokeret ved ornekontakt fra 6 dage før forsøgets start. På forsøgets startdag blev samtlige brunstige gylte mærket og 2 hold à 10 brunstige gylte blev sammensat.

Når gyltene viste tydeligt stående brunst blev de insemineret første gang. Inseminationen blev gentaget 12-18 timer senere med sæd fra samme orne. Fem dage efter sidste insemination blev gyltene slagtet og børen med æggestokke blev udtaget.

Vurdering af befrugtningsevnen

Antal ægløsninger blev bestemt som antal gule legemer. De løsnede æg blev isoleret efter skylning af æggeleder og 10-15 cm af børhornene med 20 ml PBS-skyllemedium pr. horn.

Befrugtningsraten blev bestemt efter bedømmelse af de isolerede æg. Vurderingen af ægkvaliteten blev foretaget på grundlag af dels udviklingsstadierne og dels kvaliteten. På baggrund af antal befrugtede og normalt udviklede æg blev befrugtningsraten beregnet. Antal sædceller i zonaen pr. æg blev bestemt ved tælling under mikroskop efter fordøjelse af zonaen med en trypsinopløsning.

Sædkvalitetsanalyse

Inden råsæden blev fortyndet i laboratoriet blev der udtaget en prøve. Fra sædprøven blev der udtaget en dråbe der straks blev blandet med varm farvevæske (37 °C) på et forvarmet objektglas (37 °C). Sæd og farve blev blandet og spredt tyndt ud på objektglasset så de farvede sædceller kom til at ligge enkeltvis.

Farvevæsken bestod af to dele. Eosin-farve, der kan trænge gennem døde sædcellers membraner og dermed farve sædcellerne røde. De levende sædceller lader sig ikke farve. Ved Eosinfarvningen skelnes der mellem levende og døde sædceller. Den anden farvekomponent i farvevæsken er tusch. Tusch farver ikke sædcellerne direkte men danner en mørk baggrund hvorpå de lyse sædceller kan bedømmes.

Farvemetoden inaktiverer sædcellerne og ved stor forstørrelse kan status og udseende af den enkelte sædcelle bedømmes.

En dråbe råsæd blev farvet og fordelingen af sædcelledefekter blev bestemt ved direkte mikroskopi ved 1.000 ganges forstørrelse. Den procentvise fordeling af sædcelledefekter og forholdet døde/levende sædceller blev beregnet for hver ejakulat.

Computerstyret sædanalyse

Computerstyret sædanalyse er udviklet i USA, hvor den betegnes Computer Assisted Semen Analyse, idet følgende forkortet til CASA.

Ved hjælp af CASA måles sædcellernes bevægelsesmønster og hastighed. Metoden er objektiv idet udenlandske undersøgelser har vist at resultaterne af målingerne ikke påvirkes af personen der udfører analysen. I modsætning til den visuelle bedømmelse hvor sædbedømmeren har stor betydning for resultatet.

CASA-apparatet består af en almindelig Personlig Computer (PC'er) med en billedanalyseenhed, der kan følge sædcellernes bevægelse.

Inden analysen fortyndes sæden og efter 200 ganges forstørrelse i mikroskop overføres sædbillederne via videokamera til ovennævnte PC'er. Sædcellernes bevægelsesmønster kan gemmes på videobånd og analyseres senere. I denne undersøgelse blev der optaget billedsekvenser på video for senere analyse.

Ved CASA-analysen fastfryser computeren 16 enkelte billeder med 0,04 sek.'s mellemrum. Sædcellerne følges fra billede til billede, hvorefter den enkelte sædcelles bevægelsesmønster (motilitet) og hastighed kan beregnes.

Hvert videobillede bliver af CASA inddelt i 256 linier vandret og 512 linier lodret, således at der ialt bliver 131.072 punkter i billedet. Da sædcellerne er hvide på mørk baggrund, søger CASA efter sammenhængende hvide legemer. På forhånd og èn gang for alle defineres antallet af punkter pr. sædcelle, således at CASA ikke inkluderer andre objekter end sædceller i analysen. Tyngdepunktet til den enkelte sædcelle lagres og vha. tyngdepunktet fra alle 16 enkeltbilleder beskrives sædens motilitet og hastighed.

CASA inddeler sædcellerne i forskellige grupper, afhængig af deres bevægelsesmønster:

ubevægelige sædceller
sædceller med bevægelse på stedet
fremad bevægelige sædceller (motile)

Den sidste gruppe inddeles yderligere i;

lineært bevægelige (progressiv motile)
ikke lineær bevægelige
ufysiologisk bevægelige (zig-zag, cirkelbevægelse).

Resultater

Tabel 1 viser resultaterne med 11 gylte som blev insemineret med sæd af god kvalitet og 9 gylte blev insemineret med sæd af dårlig kvalitet.

Tabel 1. Isolering og bedømmelse af løsnede æg
Sædkvalitet	Ornenr.	Antal ægløsn.	Antal æg funde,pct.	Pct. befrugtet	Antal sædceller i gennemsnit pr. zona
God	D5618	113	77,9	88,6	46,9
Dårlig	D5271	103	74,8	71,4	31,8

Sædens befrugtningsevne er blevet opgjort for hver orne som forholdet mellem total antal fundne æg i gruppen og total antal befrugtede æg af de fundne i gruppen.

Befrugtningsresultaterne i tabel 2 mellem den formodede høj- og den formodede lavfrugtbare sæd er statistisk sikker forskellig til fordel for den gode orne.

Tabel 2. Sammenligning af sædens befrugtningsevne (Antal æg)
	Sædens frugtbarhed
	Høj	Lav
Befrugtede Ubefrugtede	78 10	55 22	133 32
Total	88	77	165
Chi² = 6,72, DF=1, P<0,01.

Forskellen i det gennemsnitlige antal sædceller der omgiver hvert æg i hver af de to grupper er ligeledes statistisk sikker. Fordelingen af defekte sædceller i sæden fremgår af tabel 3.

Tabel 3. Fordeling af defekte sædceller
	Sædens frugtbarhed
Procent	høj	lav
døde celler halekrølning oprullet hale proximal dråber distaldråber defekte i alt	12,7 2,0 0,5 5,4 2,9 13,3	9,2 53,7 5 1,8 2,8 60,6

Antallet af døde sædceller i de to ejakulater er ikke væsentlig forskellig. Fordelingen af defekte sædceller viser derimod en stor forskel mellem de to orner. Forskellen skyldes primært antal sædceller med halekrølning, hvor den dårlige sæd har over 50% sædceller med denne defekt.

Tabel 4 viser resultater af CASA-analysen.

Tabel 4. CASA-analyse. Overordnet bevægelsesmønster
	Sædens frugtbarhed
Procent	høj	lav
motile sædceller, - fremad bevægelige, heraf - lineær bevægelige - ikke lineær bevægelige - ikke fysiologisk bevægelige - lokal bevægelige immotile sædceller	88 79 47 22 30 9 12	59 36 23 23 52 23 39

Forskellen i antal motile (bevægelige) sædceller er stor. Fordelingen af de fremad bevægelige sædceller i sæden med dårlig kvalitet viser at halvdelen af sædcellerne har ufysiologisk bevægelse. Dette skyldes at sædcellerne med halekrølning, bevæger sig i baglæns cirkler. Disse sædceller er sandsynligvis ikke befrugtningsdygtige.

Diskussion

Der er valgt sæd fra to orner i undersøgelsen med ekstrem forskellig kvalitet. Ornesæd skal have få defekte sædceller (under 30 pct.) og mere end 70 pct. skal være bevægelige for at sæden godkendes til insemination. Såfremt sæden ikke har disse egenskaber anses frugtbarheden for at være reduceret. Kvaliteten af sæden fra de to orner i denne undersøgelse var synligt forskellig. Denne forskel blev også observeret ved den objektive sædanalyse.

Den højfrugtbare sæd havde kun ca. 13 pct. defekte sædceller og ca. 90 pct. af sædcellerne var bevægelige. I modsætning hertil var der i den lavfrugtbare sæd over 60 pct. defekte sædceller og kun ca. 60 pct. af sædcellerne var bevægelige.

De to orners forskelle i objektiv sædkvalitet, afspejlede sig i sædens befrugtningsevne, hvor den højfrugtbare sæd resulterede i en befrugtningsprocent på 89 mod 71 efter den lavfrugtbare sæd. Forskellen i sædcellernes evne til at lokalisere befrugtningsstedet, målt som antal sædceller der omgiver hvert æg, er ligeledes statistisk sikker forskellig.

Undersøgelsen viser at, antal sædceller der omgiver hvert æg, på samme måde som befrugtningsraten, kan forudsige sædens befrugtningsevne og dermed også være et mål for sædkvaliteten.

Bestemmelsen af sædens befrugtningsevne på denne måde er hurtig, idet man ikke behøver at vente de 115 dage en drægtighed varer, inden frugtbarhedsresultatet foreligger. Metoden er dog meget arbejdskrævende og vil ikke under praktiske forhold kunne anvendes til at bestemme frugtbarhed af hvert enkelt ejakulat fra hver orne. Metoden kan derimod med fordel anvendes til at vurdere nye sædanalysers evne til at adskille høj- og lav-frugtbare orner.

I denne pilotundersøgelse er det ikke muligt ud fra værdien af de enkelte sædkvalitetsparametre at forudsige kuldstørrelsen. På baggrund af resultaterne gennemføres en undersøgelse, hvor sædkvalitetsparametres sammenhæng med kuldstørrelsen under produktionsforhold undersøges.

Sædkvalitetsparametres sammenhæng med sædens frugtbarhed