I denne artikel gennemgås resultaterne af et studium som blev gennemført i forbindelse med sædprojektet på KVL. Formålet med studiet var at undersøge interaktioner mellem bovine sædceller og et ovidukt specifikt protein, Estrus-associated protein (EAP).

I denne artikel gennemgås resultaterne af et studium som blev gennemført i forbindelse med sædprojektet på KVL (Christensen et al. 1998). Formålet med studiet var at undersøge interaktioner mellem bovine sædceller og et ovidukt specifikt protein, Estrus-associated protein (EAP). EAP udskilles af oviduktens epitel gennem hele den reproduktive cyklus, men udskilles i signifikant højre koncentration omkring brunsttidspunktet. In vitro undersøgelser har tidligere vist, at EAP bindes til sædcellerne og er i stand til at forlænge sædcellernes vitalitet. En mulig korrelation mellem befrugtningsevnen hos tyre og EAPs evne til at bindes til og bevare vitaliteten af sædcellerne blev derfor undersøgt. Konklusionerne på undersøgelsen blev, at EAP ikke bindes specifikt til sædcellerne som tidligere beskrevet. Ligeledes i modstrid med tidligere rapporter, var effekten af EAP på sædcellernes vitalitet ikke entydig, men varierede i forhold til hvilken EAP oprensningsbatch, der blev anvendt. De modstridende observationer mellem dette studium og de tidligere publikationer vedrørende EAPs effekt på sædceller udelukker ikke, at EAP er specifikt involveret i befrugtningsprocessen. Der er imidlertid brug for mere grundforskning for at forstå betydningen af glycosyleringen af EAP og dennes betydning for den biologiske funktion.

Summary
This paper reviews a study conducted within a semen research project at the Royal Veterinary and Agricultural University. The objectives of the study were to investigate interactions between bovine spermatozoa and an oviduct specific protein, the Estrus-associated protein (EAP). EAP is secreted by the oviductal epithelium during the entire estrous cycle, however in significantly higher concentrations at estrus. In vitro experiments have previously shown that EAP binds to spermatozoa and supports the viability of sperm. On this background, a possible correlation between the fertility of bulls and EAP’s ability to bind to and sustain viability of spermatozoa was investigated. The conclusions of the study were that EAP does not bind to spermatozoa in a specific manner, which is in disagreement with previous reports. Furthermore, EAP’s ability to sustain viability of spermatozoa was not consistent but varied according to the different EAP purification products. This observation is also in contrast to other studies. The contrast between the findings in this study and the previously published studies on the effects of EAP on spermatozoa does not exclude the possibility that EAP may have a specific involvement in the fertilizing process. However, more basic research is needed to understand the significance of the glycosylation of EAP and its influence on the biological function of the EAP molecule.

Introduktion

I artiklen Sædforskning og husdyravl 2 (Høier et al. 1998) blev det beskrevet, hvorledes seks ovidukt-specifikke proteiner binder sig til sædceller in vitro. Et af disse proteiner, estrus-associated protein (EAP), er blevet grundigt undersøgt med hensyn til sekretion, molekylær komposition og indvirkning på sædceller. EAP bliver udskilt i højeste koncentration i perioden omkring ovulationen (Gerena og Killian 1990), og sekretionen styres af østradiol, progesteron og luteiniserende hormon (Yanagimachi 1994, Sun et al. 1997). Bovint EAP er et glycoprotein på 85-95 kDa (Gerena og Killian 1990, King og Killian 1994), hvoraf proteindelen udgør 58 kDa. De resterede 30-40% af EAP molekylet er kulhydratkæder bestående af glukosamin, galaktosamin, galaktose, mannose og fruktose (Satoh et al. 1995). EAP er beskrevet hos flere forskellige dyrearter bl.a. får, ged, ko, gris, kanin, mus (Gandolfi et al. 1993), og proteinets opbygning er i store træk ens for de forskellige arter (70-90% identiske aminosyresekvenser). En sådan evolutionær bevarelse af et proteins struktur er formodentlig udtryk for en afgørende biologisk funktion af det pågældende protein (Gandolfi et al. 1993). Det er tidligere beskrevet, at EAP binder sig til sædceller, og denne binding er blevet påvist ved hjælp af indirekte immunocytologi og electroforese (King og Killian 1994, Abe et al. 1995a, Abe et al. 1995b). Det er ligeledes blevet demonstreret, at co-inkubation af sædceller med EAP forlænger sædcellernes overlevelse in vitro (Satoh et al. 1995, Abe et al. 1995a, Abe et al. 1995b). EAP har vist sig at kapacitere sædceller in vitro (King et al. 1994), og desuden har in vitro fertilization (IVF) studier vist, at EAP øger befrugtningsraten (Way et al. 1997).

På baggrund af ovennævnte publikationer blev der ved sædprojektets start (Christensen et al. 1998) formuleret en hypotese om, at mængden af EAP, som binder sig til sædcellerne, varierer fra tyr til tyr, og at dette muligvis ville kunne udnyttes til at beskrive tyrenes befrugtningsevne. Desuden var det ønskeligt at undersøge om EAP kunne forlænge sædcellernes vitalitet, og i givet fald om der var forskel på denne effekt fra tyr til tyr. På baggrund af disse hypoteser blev der iværksat et delprojekt vedrørende EAP, hvor målet var at påvise bindingen af EAP til sædceller både kvalitativt og kvantitativt samt at undersøge effekten af EAP på sædcellernes vitalitet.

Materialer og metoder

EAP kilder

EAP blev oprenset fra in vivo opsamlet oviduktvæske eller fra oviduktceller opsamlet fra slagtehus materiale. Oviduktvæsken blev opsamlet ved at indoperere katetere i bovine ovidukter som beskrevet af Kavanaugh og Killian (1988). Dyrenes østrale status blev fastslået på baggrund af daglig analyse af serumprogesteronindholdet. Koen blev defineret som værende i østrus (Ø), når serumprogesteronindholdet på opsamlingsdagen var <1,5 ng/ml, og i diøstrus (DØ), ved et serumprogesteronindhold på >1,5 ng/ml. Oviduktvæske opsamlet i de to faser blev hold adskilt.

Bovine hunkønsorganer blev indsamlet på et slagtehus. Ovarierne blev vurderet for tilstedeværelsen af en preovulatoriske follikler og et regressivt corpus luteum eller tegn på nylig ovulation. Disse organer blev defineret som værende fra en ko i østrus (Ø). Organer med et stort corpus luteum blev defineret som værende fra en ko i diøstrus (DØ). Ovarier, der viste tegn på polycystisk ovarialsyndrom eller luteincyster, blev ikke anvendt. Organer fra østrus og diøstrus blev holdt adskilte. Ovidukterne blev dissekeret fri og oviduktcellerne blev høstet ved at presse cellerne ud af ovidukten med en pincet. Cellerne blev efterfølgende lyseret ved gentagen frysning ved ÷18 °C og optøning (i alt 6 gange). Herefter blev de lyserede celler centrifugeret ved 10.000 x g i 20 min ved 4 °C, og supernatanten blev anvendt til oprensningen.

Oprensning af EAP

Ammoniumsulfatfældning blev benyttet i oprensningen af EAP. Den EAP-holdige fraktion fældes ved en ammoniumsulfatkoncentration mellem 35-65% af mætning. For at oprense EAP yderligere blev de fældede proteiner opslæmmet i 50 mM TRIS buffer ("pH" 7,4) og blev derefter hældt på en WGA⁽¹ kromatografisk søjle. Ved den kromatografiske proces blev EAP bundet til søjlen, mens resten af proteinerne i prøven passerede igennem. Efterfølgende kunne EAP frigøres fra søjlen ved at benytte 100mM glucosamin buffer som elueringsvæske. Der blev kørt éndimensional elektroforese (1D SDS-PAGE) og Western blot på 10 µg oprenset EAP fra hver batch som kontrol af oprensningsproduktet. Det oprensede EAP blev brugt til forsøg, såfremt der ved elektroforese og Western blot blev visualiseret et enkelt proteinbånd med en molekylevægt mellem 97,4 og 81,0 kDa.

Immunocytologisk påvisning af EAP binding

Eksperiment 1

Der blev opsamlet sæd fra 3 tyre. Indledningsvis blev sædcellerne separeret fra sædplasma ved at centrifugere ejakulaterne ved 250 x g i 10 min. Supernatanten blev fjernet, og 1 ml sædceller blev resuspenderet til 10 ml med MTM⁽² forvarmet til 37 °C og centrifugeret. Denne procedure blev gentaget endnu en gang og sædkoncentrationen blev bestemt ved hjælp af et Makler kammer (Sefi-Medical Instruments Ltd., Haifa, Israel). Sædcellerne blev fortyndet til 50 x 10⁶ ml med MTM, og 5 ml sæd fra hver af de 3 tyre blev blandet. Herefter blev der lavet udstrygnings præparater med 10 µl sædblanding. Disse blev efterfølgende inkuberet i 4 timer ved 37°C med MTM tilsat EAP (0,5 mg/ml) eller med MTM uden tilsætning (kontrol). Dette blev gjort ved at placere 300 µl medium på udstrygningspræparaterne og pålægning af dækglas. Efter inkubationen blev der udført indirekte immunocytologi på alle præparaterne. Et polyklonalt kanin IgGantistof mod EAP (Almquist Research Center, Penn State University, PA, USA) blev brugt som primært antistof i en 10 og 100 µg/ml fortynding med MTM. Et FITC mærket F(ab')2 fragment mod kanin IgG (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) fortyndet 1: med MTM blev brugt som sekundært antistof. Som positiv kontrol blev der anvendt et polyklonalt kanin IgG antistof mod sædcellemembranen (Almquist Research Center, Penn State University, PA, USA). Som negativ kontrol blev antistoffer oprenset fra ikke immuniserede kaniner anvendt. Alle præparater blev vurderet ved 200x forstørrelse på et BX60 fluorecens mikroskop (Olympus Danmark A/S, Albertslund, Danmark).

Eksperiment 2

Sædbehandlingen var den samme som i eksperiment 1, men med følgende modifikationer. Sædcellerne blev fortyndet med MTM tilsat gedeserum (5%), Tween-20 (5%), Triton X-100 (5%) eller gelatine (0,2%). Udstrygningspræparaterne blev inkuberet i 4 timer ved 37°C med 300 µl MTM tilsat EAP (0,5 mg/ml) eller med MTM (kontrol). Efterfølgende blev alle præparater vurderet ved hjælp af indirekte immunocytologi som beskrevet i eksperiment 1.

Eksperiment 3

Sædbehandlingen var den samme som i eksperiment 1, bortset fra følgende modifikationer. Sædcellerne blev fortyndet i Fc-receptor⁽³-blokkermedium (Accurate Chemicals and Scientific Corp., New York, NY, USA). Udstrygningspræparaterne blev inkuberet i 4 timer ved 37 °C med 300 µl MTM tilsat EAP (0,5 mg/ml) eller med MTM (kontrol). Efterfølgende blev alle præparater vurderet ved hjælp af indirekte immunocytologi som beskrevet i eksperiment 1.

Eksperiment 4

Sædbehandlingen var den samme som i eksperiment 1. Udstrygningspræparaterne blev inkuberet i 4 timer ved 37 °C med 300 µl MTM tilsat EAP (0,5 mg/ml) eller med MTM (kontrol). Efterfølgende blev alle præparater vurderet ved hjælp af indirekte immunocytologi som beskrevet i eksperiment 1 med følgende modifikationer. De polyklonale kanin IgGantistoffer blev enzymatisk fordøjet med pepsin til F(ab')2 fragmenter. F(ab')2 fragmenterne blev herefter oprenset ved hjælp af protein A kromatografi og brugt som primære antistoffer.

Eksperiment 5

Sædbehandlingen var den samme som i eksperiment 1. Udstrygningspræparaterne blev inkuberet i 4 timer ved 37 °C med 300 µl MTM tilsat EAP (0,5 mg/ml) eller med MTM (kontrol).

Efterfølgende blev præparaterne fikseret i paraformaldehyd (1%), ethanol (95%) eller acetone (95%) eller permeabiliseret i en 1:100 fortynding af Jones buffer (Jones og Brown 1987). Efterfølgende blev alle præparater vurderet ved hjælp af indirekte immunocytologi, hvor F(ab')2 fragmenterne af antistofferne blev brugt som primære antistoffer som beskrevet i eksperiment 4.

Eksperiment 6

I dette eksperiment blev protokollen til påvisning af EAPs binding til sædceller, beskrevet af King og Killians (1994), fulgt. Ejakulater fra 2 tyre blev opsamlet, og fra hvert ejakulat blev 1 ml sæd fortyndet med 9 ml MTM og centrifugeret ved 1000 x g i 20 min. Supernatanten blev fjernet og proceduren blev gentaget én gang. Sædkoncentrationen blev justeret til 1 x 10⁹ sædceller/ml med MTM og 10 ml sæd fra de 2 tyre blev blandet. Sædcellerne blev herefter inkuberet ved 39 °C i MTM tilsat oviduktvæske (5 mg protein pr. ml) eller i MTM uden tilsætning (kontrol). Ved eksperimentets begyndelse (0 timer) og efter 4 timers inkubation blev der lavet udstrygningspræparater med 10 µl sædblanding. Præparaterne blev fikseret i 95% methanol i 5 min og opbevaret ved ÷18°C til senere brug. Præparaterne blev optøet ved stuetemperatur og sædcellemembranerne blev delvist permeabiliseret ved inkubation i en 1:100 fortynding af Jones buffer i PBS-T⁽⁴ i 30 min ved 4°C. Præparaterne blev inkuberet i PBS-T tilsat 5% gedeserum i 30 min, hvorefter der blev udført indirekte immunocytologi. Det polyklonale kanin IgGantistof mod EAP blev brugt som primært antistof i en 5 µg/ml fortynding med MTM. Det sekundære antistof var et HRP⁽⁵ mærket F(ab')2-fragment mod kanin IgG (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA) fortyndet 1:10000 med MTM. Bindingen blev efterfølgende visualiseret ved hjælp af et DAB⁽⁶ enzymsystem og analyseret ved 200 x forstørrelse på et BX60 lys mikroskop (Olympus Danmark A/S, Albertslund, Danmark).

Figur. Påvisning af EAPs association med sædcellemembranen ved hjælp af Western blot, dot blot og Ensyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Eksperiment 7

Sædbehandlingen var identisk med eksperiment 1, dog blev sædcellerne fortyndet til 100 x 10⁶ ml med MTM før fortyndet sæd fra de 3 tyre blev blandet. Til 2,5 ml af sædblandingen blev der tilsat 2,5 ml behandlingsmedium eller MTM uden tilsætning (kontrol). Behandlingsmedium var enten MTM tilsat østrus oviduktvæske (0,5 mg EAP/ml) eller EAP (0,5 mg/ml) oprenset fra henholdsvis østrus oviduktvæske, fra østrus oviduktceller eller fra diøstrus oviduktceller. Sædcellerne blev herefter inkuberet i 4 timer ved 37 °C. Efter inkubationen blev prøverne centrifugeret ved 500 x g i 10 min. Supernatanten blev fjernet, og der blev tilsat 10 ml MTM hvorefter centrifugeringen blev gentaget. Fortyndingen og centrifugeringen blev gentaget, og fra de centrifugerede sædceller blev membranproteinerne ekstraheret ved at tilsætte 500 µl Jones buffer og inkubere sædcellerne i 1 time ved 4°C. Under inkubationen blev prøverne blandet hvert 15. min. Efter inkubationen blev prøverne centrifugeret ved 10000 x g i 30 min. Supernatanterne indeholdende membranproteinerne blev koncentreret og udsat for et bufferskifte til 50 mM TRIS buffer (pH 7,4) ved at anvende et Microcon centrifugeringsfilter

(Amicon Inc., Beverly, MA, USA). Tilstedeværelse af EAP i membranproteinfraktionen blev undersøgt ved hjælp af Western blot, dot blot og ELISA (Høier et al. 2000).

Undersøgelse af sædens vitalitet under inkubering med EAP

Eksperiment 8

Sæd fra 2 tyre blev centrifugeret (250 x g i 10 min) og fortyndet med TLP⁽⁷ til 100 x 10⁶ celler/ml som beskrevet i eksperiment 1. Sædcellerne blev herefter inkuberet i 48 timer ved 37 °C i TLP tilsat østrus oviduktvæske (0,5 mg EAP/ml), EAP (0,5 mg /ml) eller TLP uden tilsætning (kontrol). På startstidspunktet og efter henholdsvis 1, 2, 4, 6, 24 og 48 timer blev procentdelen af vitale sædceller bestemt ved indfarvning i 10 min med 100nM SYBR-14 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og 12µM propidium iodide (PI, Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Prøverne blev herefter analyseret ved hjælp af et flowcytometer (FACStar Plus, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Tabel 1. ELISA målinger af EAP indeholdet i sædcellermembranfraktionen efter inkubertion i MTM (kontrol) eller i dette medium tilsat oviduktvæske eller EAP oprenset fra østrus oviduktvæske, østrus oviduktceller eller diøstrus oviduktceller (resultaterne er gennemsnit + SEM). EAP indholdet i inkubationsmedierne før inkubationen blev justeret til 0,5 units pr. ml (u/ml) med MTM på baggrund af ELISA målinger af udgangsmaterialet. EAP indholdet i inkubationsmedierne efter inkubationen er målt med ELISA efter inkubationen (resultaterne er gennemsnit ± SEM)

	-------------------- EAP indhold --------------------
Behandling	Membranprotein- fraktion (µ/ml)	Inkubationsmedium før inkubationen (µ/ml)	Inkubationsmedium efter inkubationen (µ/ml)
MTM (kontrol)	1,47 ± 0,40^c	0	0
MTM + EAP fra østrus oviduktceller	6,74 ± 1,96^a	0,5
MTM + EAP fra østrus oviduktvæske	5,93 ± 0,14^a,b	0,5	0,3 ± 0,13
MTM + EAP fra diøstrus oviduktceller	3,12 ± 0,33^b,c	0,5
MTM + østrus oviduktvæske	5,54 ± 1,62^a,b	0,5
a, b, c: Grupper med samme bogstav er ikke signifikant forskellige fra hinanden (p>0,05)

Eksperiment 9

Dette eksperiment blev gentaget på to forskellige forsøgsdage. Sæd fra 4 tyre blev centrifugeret og fortyndet med TLP til 100 x 10⁶ sædceller pr. ml som beskrevet i eksperiment 8. Sædcellerne blev inkuberet i 24 timer ved 37 °C i TLP tilsat østrus oviduktvæske (0,5 mg EAP/ml), EAP (0,5 mg /ml) eller TLP (kontrol). På starttidspunktet og efter henholdsvis 1, 2, 4, 6, 9, 12 og 24 tim er blev procentdelen af vitale sæd celler bestemt som beskrevet i eksperiment 8.

Resultater

Immunocytologisk påvisning af EAP binding

I eksperiment 1 var den positive kontrol som forventet positiv (fig. 1), og der sås en tydelig fluorescens på sædcellernes mellemstykke og hoved. Den negative kontrol var ligeledes positiv (fig. 2), og det samme var tilfældet for testen for EAP binding (fig. 3). Ved brug af gedeserum, Tween-20, Triton X-100, gelatine eller Fc receptorblokker (eksperiment 2 og 3) var det ikke muligt at blokere den uspecifikke binding af de primære antistoffer, som blev observeret i eksperiment 1. Når F(ab')2 fragmenter af de primære antistoffer blev anvendt i stedet for hele IgG molekyler (eksperiment 4) viste resultaterne, at den positive kontrol for den immunocytologiske teknik var positiv (fig. 4). Den negative kontrol var nu som forventet negativ (fig. 5), og det samme var tilfældet for testen for EAP binding (fig. 6). EAP binding kunne ikke påvises efter fiksering af sædcellerne med parformaldehyd, ethanol eller acetone eller permeabilisering med Jones buffer (eksperiment 5). Da en tidligere publiceret protokol til påvisning af EAP binding blev fulgt i eksperiment 6 var resultatet at både de positive og negative kontroller samt testen for EAP binding viste tegn på binding.

Påvisning af EAPs association med sædcelle membranen ved hjælp af Western blot, dot blot og ELISA

Ved Western blot blev der ikke påvist EAP i sædcellemembran proteinfraktionen. Ved dot blot blev der registret en meget svag farve reaktion som tegn på EAPs tilstedeværelse i membranfraktionen fra sædceller, der havde været inkuberet i østrus oviduktvæske. ELISA-teknikken kunne derimod påvise EAP i alle membranfraktioner fra sædceller, som havde være inkuberet i EAP-holdigt medium (tabel 1). Med ELISA teknikken kunne koncentrationen af det påviste EAP kvantificeres, og i membranfraktionerne var koncentrationen af EAP ca. 1000 gange lavere end i inkubationsmedium før inkubationen (tabel 1).

Undersøgelse af sædens vitalitet under inkubering med EAP

I eksperiment 8 (fig. 7) var vitaliteten af sædcellerne i EAP-holdigt medium signifikant (p<0,001) bedre på alle måletidspunkterne (bortset fra starttidspunktet) sammenlignet med inkubering i kontrolmedium og medium tilsat oviduktvæske. I eksperiment 9 (fig. 8) var der ingen signifikante forskelle på sædcellernes vitalitet ved de forskellige behandlinger de første 2 timer. Herefter var sædcellernes vitalitet signifikant (p<0,005) lavere i medium tilsat EAP.

Figur 7. Figuren viserprocent vitale sædsæller (gennemsnit) over 498 timers inkubation i MTM (kontrol) samt EAP eller oviduktvæske (eksperiment 8)

Figur 8. Figuren viserprocent vitale sædsæller (gennemsnit) over 498 timers inkubation i MTM (kontrol) samt EAP eller oviduktvæske (eksperiment 8)

Diskussion

Eksperiment 1 viste, at de primære antistoffer bandt sig til sædcellerne, hvilket gav sig udslag i en falsk negativ kontrol (fig.2). På den baggrund kunne den mærkning af sædcellerne, som blev iagttaget ved test for EAP binding (fig. 3), evt. også skyldes et falsk positivt resultat. Forskellige forsøg på at blokere den uspecifikke binding med gedeserum, Tween 20, Triton X-100, gelatine eller Fc receptor blokker (eksperiment 2 og 3) viste sig at være utilstrækkelig til at opnå negative kontroller. Derimod resulterede anvendelsen af F(ab')2 fragmenter af de primære antistoffer i, at der ikke længere var uspecifik binding (eksperiment 4, fig. 5). Denne ændring medførte dog samtidig, at der ikke kunne påvises binding af EAP til sædcellerne (fig. 6). I eksperiment 5 blev forskellige stoffer (paraformaldehyd, ethanol, acetone eller Jones buffer) brugt til at undersøge, om EAP var inkorporeret i sædcellemembranen. Ingen af disse tiltag gav dog anledning til, at der blev observeret tegn på EAP binding. Protokollen beskrevet af King og Killian (1994) blev anvendt i eksperiment 6, hvor der blev observeret de samme problemer med uspecifik binding, som beskrevet for eksperiment 1. Konklusionen af de immunocytologiske forsøg var derfor, at EAP ikke binder sig specifikt til sædceller. Richards og Witkin (1984) rapporterede en uspecifik binding af kaninantistoffer til sædceller og anbefalede brug af F(ab')2 fragmenter eller monoklonale antistoffer for at undgå dette problem. F(ab’)2 fragmenter er ikke tidligere anvendt til studier af EAP binding, mens monoklonale antistoffer blev anvendt af Abe et al. (1995a). I begge studier (King og Killian 1994, Abe et al. 1995a) blev der dog ikke anvendt negative kontroller, hvilket må siges at være en mangel ved deres forsøg. Resultaterne af nærværende forsøg understøttes af Nancarrow & Hill (1995), som ikke kunne påvise binding af ovint EAP til væddersædceller. Årsagen kan være, at EAP ikke bindes til sædcellerne via en receptor, men at der sker en løs association af EAP til sædcelle membranen.

Association af EAP til sædcellemembraner er tidligere påvist efter inkubation af sædceller i isotop- eller biotin-mærket oviduktvæske (McNutt et al. 1992, King og Killian 1994, Rodriguez og Killian 1998). I eksperiment 7 blev binding af EAP til sædcellemembranen undersøgt ved hjælp af Western blot, dot blot og ELISA, og resultaterne viste, at der kun ved ELISA kunne påvises EAP i membran proteinfraktionen (tabel 1). Resultaterne indikerer, at Western blot og dot blot ikke er så sensitive som ELISA, hvor selv meget små mængder af EAP kunne spores (tabel 1). Mængden af EAP som påvistes i membranfraktionerne efter inkubation var imidlertid væsentlig mindre end den mængde af EAP, der forsvandt fra medierne som følge af inkubationen af sædcellerne (tabel 1). Årsagen til denne forskel kan være, at EAP ved inkubationen associeres løst til sædcellemembranen og derefter fjernes ved efterfølgende vask og centrifugering.

EAP’s påvirkning af sædcellefunktionen blev undersøgt i eksperiment 8, hvor sædcellers overlevelse ved inkubation med EAP og oviduktvæske blev bestemt ved hjælp af flowcytometri. Eksperiment 8 viste (fig. 7), at sædceller overlever længere ved inkubation med EAP eller oviduktvæske, og dette resultat er i overensstemmelse med tidligere studier (McNutt og Killian 1991, Satoh et al. 1995, Abe et al. 1995a, Abe et al. 1995b). Et mere omfattende forsøg (eksperiment 9) til beskrivelse af sædcelleoverlevelsen ved tilstedeværelse af EAP og oviduktvæske blev gennemført med henblik på at beskrive forskel på tyre og ejakulater indenfor tyr. Resultatet af eksperiment 9 var imidlertid, at procentdelen af levende sædceller faldt markant efter 4 timers inkubation ved EAP behandlingen, og at der ikke var signifikant forskel på inkubation i oviduktvæske og kontrolbehandlingen (fig. 8). Disse forskelle i effekten af EAP blev også observeret i et tredje forsøg, hvor 3 forskellige oprensninger af EAP blev anvendt. De anvendte oprensninger af EAP havde alle en negativ effekt på sædcellernes overlevelse (Bang Knudsen 2000).

En gennemgang af litteraturen viser, at EAP og oviduktvæske også er rapporteret at have en kapaciterende effekt på sædceller (Parrish et al. 1989, King et al. 1994, Mahmoud og Parrish 1996, Verhage et al. 1997). Kapacitation er en reversibel og ustabil tilstand, som når den efterfølges af akrosom reaktion, resulterer i celle død i løbet af mindre end en time (Mortimer et al. 1988, Harrison og Vickers 1990). Resultater som peger på at EAP forlænger sædcellernes overlevelse (McNutt og Killian 1991, Satoh et al. 1995, Abe et al. 1995a, Abe et al. 1995b) er derfor i modstrid med en kapaciterende effekt (Parrish et al. 1989, King et al. 1994, Mahmoud og Parrish 1996, Verhage et al. 1997). Årsagen til disse forskelle i litteraturen og de modstridende resultater i eksperiment 8 og 9 er ikke blevet klarlagt i nærværende projekt, men der kan peges på flere mulige årsager. Det er kendt, at et proteins biologiske effekt er tæt knyttet til graden af glycosylering, hvor deglycosylering af et enkelt kulhydrat kan ændre effekten af proteinet radikalt (Gerard 1990). EAP optræder i mindst 7 glycoformer, og disses tilstedeværelse er tæt knyttet til både cyklustidspunkt og den region af ovidukten, som undersøges (Vieira og Killian 1999). Det er derfor vigtigt, at råmaterialet til EAP oprensning er standardiseret med hensyn til tidspunkt i østral cyklus. Oviduktvæske bør ligeledes standardiseres med hensyn til en regional opsamling eller opsamling fra hele ovidukten. Såfremt EAP oprenses fra oviduktceller bør der ligeledes tages hensyn til regionale forskelle, og forskel i glycosylering af EAP oprenset fra ovidukt celler og oviduktvæske. I nærværende projekt var der behov for relativt store mængder af EAP, og de oprensede EAP-fraktioner blev anvendt, såfremt der ved 1D SDS- PAGE og Western blot blev lokaliseret èt bånd med en molekylvægt mellem 81 og 91,7 kDa. Disse kriterier kan dog ikke påvise mindre ændringer i molekylvægten, som kan skyldes forskelle i glycosylering. Ved fremtidige studier af EAP’s bør der derfor lægges vægt på at analysere glycosylering af de oprensede EAP produkter, således at de forskellige glycoformers effekt på sædceller kan beskrives.

En mulig teori vedrørende EAP’s funktion er, at EAP er involveret i en dynamisk proces med gameterne og epithelet i ovidukten, hvor EAP har funktion som kulhydratdonor. Kulhydrater er centralt involveret i befrugtningsprocessen, idet interaktioner mellem sædcellen og ovidukten samt mellem sædcelle og oocyt opstår som følge af et kulhydrat-baseret bindingssystem (Töpfer-Petersen 1999). Yderligere undersøgelser af EAP's funktion bør rettes imod at afklare betydningen af glycosyleringsgraden af EAP. Nærværende projekt peger på, at der ikke sker en egentlig binding af EAP, men en løs association af EAP til sædcellens membran. Yderligere undersøgelser bør derfor rettes imod at undersøge effekten på sædceller (overlevelse, capacitation, akrosom reaktion) og interaktionen mellem sædcelle og oocyt.

⁽¹	Wheat germ agglutinin: et lectin med høj affinitet for kulhydratet galatosamin.
⁽²	Modfied Tyrode’s medium.
⁽³	Et antistof består af to Fab dele og en Fx del. I en lang række væv er der receptorer for Fc delen som kan give sig udslag i falsk positive reaktioner ved immunocytologi.
⁽⁴	Phosphate buffed saline tilsat 0,5% rween-20.
⁽⁵	Horseradish peroxidase.
⁽⁶	3,3’.diaminobenzidin.
⁽⁷	Tyrodes medium med lactat og pyruvat.

Anerkendelse

Sædprojektet er finansieret af danske kvægavlsforeninger og ornestationer samt via støtte fra Direktoratet for FødevareErhverv (J. Nr. 93S-2465-Å97-00705).

Litteratur

Abe H, Sendai Y, Satoh T, Hoshi H: Bovine oviduct-specific glycoprotein: A potent factor for maintenance of viability and motility of bovine spermatozoa in vitro. Mol Reprod Dev 1995a, 42, 226-232.

Abe H, Sendai Y, Satoh T, Hoshi H: Secretory products of bovine oviductal epithelial cells support the viability and motility of bovine spermatozoa in culture in vitro. J Exp Zool 1995b, 272, 54-61.

Bang Knudsen D: Estrus-associated protein (EAP) - Interactions of EAP with spermatozoa in vitro. Ph.d. afhandling. DSR- Grafik, Frederiksberg, Danmark. 2000.

Christensen P, Johansen D, Høier R, Lehn-Jensen H: Sædforskning og husdyravl 1. Orientering om sædforskning på KVL. Dansk Veterinærtidsskrift 1998, 81, 338-340.

Gandolfi F, Passoni L, Modina S, Brevini TAL, Varga Z, Lauria A: Similarity of an oviduct-specific glycoprotein between different species. Reprod. Fertil. Dev. 1993, 5, 433-443.

Gerard C: Purification of glycoproteins. In: Deutscher M (ed). Guide to protein purification. Academic Press Inc., San Diego, CA, USA., 1990, pp 529-539.

Gerena RL, Killian GJ: Electrophoretic characterization of proteins in oviduct fluid of cows during the estrous cycle. J Exp Zool 1990, 256, 113-120.

Harrison RAP, Vickers SE: Use of fluorescent probes to assess membrane integrity in mammalian spermatozoa. J Reprod Fertil 1990, 88, 343-352.

Høier R, Bang Knudsen D, Killian G: Estrus-associated protein (EAP) in bovine oviductal fluid (ODF) during the estrus cycle measured by an ELISA method. Indsendt til publikation i Animal Reproduction Science.

Høier R, Johansen D, Christensen P, Lehn-Jensen H: Sædforskning og husdyravl 2. Bovine ovidukt-specifikke proteiner og deres indflydelse på befrugtningsprocessen. Dansk Veterinærtidsskrift 1998, 81, 482-485.

Jones R, Brown CR: Identification and characterization of the 2D6 and Mr 23000 antigens on the plasma membrane of rat spermatozoa. Biochem J 1987, 241, 353-360.

Kavanaugh JF, Killian GJ: Bovine oviductal cannulations. J Invest Surg 1988, 1, 201-208.

King RS, Anderson SH, Killian GJ: Effect of bovine oviductal estrus-associated protein on the ability of sperm to capacitate and fertilize oocytes. J Androl 1994, 15, 468-478.

King RS, Killian GJ: Purification of bovine estrus-associated protein and localization of binding on sperm. Biol Reprod 1994, 51, 34-42.

Mahmoud AI, Parrish JJ: Oviduct fluid and heparin induce similar surface changes in bovine sperm during capacitation: A flow cytometric study using lectins. Mol Reprod Dev 1996, 43, 554-560.

McNutt T, Rogowski L, Vasilatos Younken R, Killian G: Adsorption of oviductal fluid proteins by the bovine sperm membrane during in vitro capacitation. Mol Reprod Dev 1992, 33, 313-323.

McNutt TL, Killian GJ: Influence of bovine follicular and oviduct fluids on sperm capacitation. J Androl 1991, 12, 244-252.

Mortimer D, Chorney M.J., Curtis E.F., Trounson AO:Calcium dependence of human sperm fertility. J Exp Zool 1988, 246, 194-201.

Nancarrow CD, Hill JL: Oviduct proteins in fertilization and early embryo development. J Reprod Fertil 1995, Suppl 49, 3- 13.

Parrish JJ, Susko-Parrish JL, Handrow RR, Sims MM, First NL: Capacitation of bovine spermatozoa by oviduct fluid. Biol Reprod 1989, 40, 1020-1026.

Richards JM, Witkin SS: Non-immune IgG binding to the surface of spermatozoa by disulphide rearrangement. Clin Exp Immuno 1984, 58, 493-501.

Rodriguez C, Killian G: Identification of ampullary and isthmic oviductal fluid proteins that associate with the bovine sperm membrane. Anim Reprod Sci 1998, 54, 1-12.

Satoh T, Abe H, Sendai Y, Iwata H, Hoshi H: Biochemical characterization of a bovine oviduct-specific sialo- glycoprotein that sustains sperm viability in vitro. Biochim Biophys Acta 1995, 1266, 117-123.

Sun T, Lei ZM, Rao CV: A novel regulation of the oviductal glycoprotein gene expression by luteinizing hormone in bovine tubule epithelial cells. Mol Cell Endocrin 1997, 131, 97-108.

Töpfer-Petersen E: Carbohydrate-based interactions on the route of a spermatozoon to fertilization. Human Reprod Update 1999, 5, 314-329.

Verhage HG, Fazleabas AT, Mavrogianis PA, O'Day-Bowman MB, Schmidt A, Arias EB, Jaffe RC: Characteristics of an oviductal glycoprotein and its potential role in fertility control. J Reprod Fertil 1997, Suppl 51, 217-226.

Vieira EG, Killian GJ: Evidence for multiple forms of estrus- associated protein in bovine oviductal fluid associated with oviduct region and stage of the estrous cycle. Biol Reprod 1999, 60, 202.

Way AL, Schuler AM, Killian GJ: Influence of bovine ampullary and isthmic oviductal fluid on sperm-egg binding and fertilization in vitro. J Reprod Fertil 1997, 109, 95-101.

Yanagimachi R: Mammalian fertilization. In: Knobil E, Neill J (eds). The physiology of reproduction. Raven Press, New York, NY. USA, 1994, pp 190-317.

*

Sædforskning og husdyravl 1 - Orientering om sædforskning på KVL var offentliggjort i DVT nr. 9, 1. maj 1998.

Sædforskning og husdyravl 2 - Bovine ovidukt-specifikke proteiner og deres indflydelse på befrugtningsprocessen var offentliggjort i DVT nr. 13, 1. juli 1998.

Sædforskning og husdyravl 3 - Sædkvalitet og frugtbarhed hos tyre og orner var offentliggjort i DVT nr. 3, 1. februar 2001.

Kilde: Dansk Veterinærtidsskrift nr. 4, 15. februar 2001, 84. årgang side 6-11

Sædforskning og husdyravl 4*