Den immunogene aktivitet af vacciner mod nysesyge kan måles i serum på vaccinerede grise med en VERO celle metode eller med ELISA.

Den immunogene aktivitet af vacciner mod nysesyge kan måles i serum på vaccinerede grise med en VERO celle metode eller med ELISA. I undersøgelsen sammenlignes den serologiske respons målt på serumprøver, der er indsamlet i henholdsvis en spansk og en dansk undersøgelse (tabel 1).

De to metoder gav meget identiske resultater for de enkelte dyr. Der var imidlertid stor forskel på det gennemsnitlige titerniveau, som de forskellige vacciner gav anledning til (figur 1 & 2).

Baggrund

Nysesyge (Progressiv atrofisk rhinitis) hos grise er en alvorlig sygdom, der kan forårsage alvorlige økonomiske tab i de angrebne besætninger (de Jong, 1999). Sygdommen skyldes infektion med toksin-producerende Pasteurella multocida bakterier og forskellige medvirkende faktorer. Læsionerne, der forårsager de skæve tryner, skyldes Pasteurella multocida toksinet (PMT). PMT er beskrevet af Foged (1988) og den genetiske basis er klarlagt af Petersen & Foged (1989). Sygdommen kan forebygges ved overførsel af maternel immunitet, hvis soen er vaccineret med en vaccine, der er istand til at fremprovokere tilstrækkeligt høje antistoffer i kolostrum. Sådanne vacciner kan være baseret på inaktiveret PMT fra P. multocida og være tilsat olie-adjuvans (Pennings & Storm, 1984 ) eller aluminiumhydroxyd-adjuvans (se f.eks. Pedersen & Barfod,1982 og Kovacs & Magyar, 1996) eller kan indeholde dO-protein og aluminiumhydroxid- adjuvans (Nielsen og medarbejdere,1991). Vaccinernes immunogene aktivitet kan måles med VERO celle metoden beskrevet af Pennings & Storm (1984) eller med ELISA som beskrevet af Foged og medarbejdere (1988). I denne artikel sammenlignes de to metoder ved at analysere 2 sæt serumprøver.

Materiale & Metoder

De serumprøver, der blev analyseret, stammede fra 2 vaccinationsforsøg i henholdsvis Spanien og Danmark. I Spanien indgik der flere grupper af vaccinerede dyr og en gruppe af ikke vaccinerede grise. I Danmark var der 2 grupper vaccinerede dyr og en kontrolgruppe. Inddelingen i grupper blev foretaget ved lodtrækning. Dyrene blev vaccineret som angivet på de respektive indlægssedler. Alle dyrene i vaccinegrupperne fik to vaccinationer. Intervallet mellem de to vaccinationer var 2-4 uger, bortset fra gruppen Porcilis AR-T-6uger, hvor der var 6 uger mellem de to vaccinationer. Grisene blev blodprøvet før første vaccination og 2 uger efter anden vaccination. Prøverne blev centrifugeret og forsynet med løbenummer og serum blev opbevaret ved ÷20ºC, indtil analyserne blev udført. Først efter at analyserne var udført, blev koden brudt, og det kunne konstateres, hvilke dyr prøverne stammede fra. I alt blev der analyseret 133 serumprøver fra 68 grise (Tabel 1).

Tabel 1. Oversigt over prøver og grupper

Oprindelse	Vaccine	Antal før 1. vacc.	Antal efter 2. vacc.
Danske prøver	Atrinord DO	7	6
	Ingelvac DART	6	5
	Kontrol	10	10
Spanske prøver	Porcillis AR-T (6 ugers interval)	5	5
	Porcillis AR-T (4 ugers interval)	5	5
	Cyvax AR (DNT)	10	9
	Rinipravad DT	10	10
	Ingelvac RA4	10	10
	Kontrol	5	5

VERO celle metoden blev udført som beskrevet af Pennings & Storm (1984). Denne metode er baseret på, at PMT hæmmer væksten af kulturer af VERO celler. Denne væksthæmning kan neutraliseres, hvis der tilsættes serum med antistoffer til kulturen. ELISA blev udført som beskrevet af Foged og medarbejdere (1988). Ved denne metode blandes serumprøven med en bestemt mængde PMT og derefter bestemmes mængde af overskydende PMT ved hjælp af monoklonale antistoffer.

Figur 1. PMT titre 2 uger efter anden vaccination bestemt med ELISA

Resultater

De to analysemetoder viste meget ens resultater for de enkelte prøver. Ved første prøvetagning viste alle dyrene en titer på 1 eller mindre end 1, både i VERO celler og ved ELISA, og alle prøverne blev derfor betegnet som negative. Ved prøven udtaget 2 uger efter anden vaccination var alle kontroldyrene ligeledes seronegative i begge metoder. De titre, der blev målt hos de vaccinerede dyr efter anden vaccination, er illustreret i figur 1 og 2. Inden for alle grupperne af vaccinerede dyr var der en særdeles god overensstemmelse mellem de titre, der blev målt med de to metoder. Der var imidlertid stor forskel på de gennemsnitlige titerværdier, der blev opnået med de forskellige vacciner. Vaccinerne Porcilis AR-T og Atrinord DO gav konstant høje titre hos alle de vaccinerede dyr. I prøverne fra de dyr, der var vaccineret med Porcilis AR-T, var gennemsnits titeren 4,6 i VERO celler og 3,3 i ELISA i de grise, der havde 4 uger mellem første og anden vaccination. I den gruppe, der havde 6 ugers interval mellem vaccinationerne, var titrene 8,4 i VERO celler og 4,9 i ELISA. De danske grise, der var vaccineret med Atrinord DO, nåede som gennemsnit 5,3 i VERO celler og 3,7 med ELISA. Vaccination med Ingelvac RA4 eller Rinipravac DT resulterede ikke i en målelig titerstigning. Blandt de grise, der var vaccineret med Cyvax AR i Spanien havde nogle titerstigning mens andre forblev seronegative, og derfor nåede den gennemsnitlige titerværdi kun op på 3,2 i VERO celler og 2,5 i ELISA. De danske grise vaccineret med Ingelvac DART fik ingen titre i VERO celler, mens to grise responderede i ELISA og fik en gennemsnitlig titer på 2,3. Det var meget tydeligt, at der var en klar sammenhæng mellem titerværdien og hvilken vaccine, der var anvendt, uanset hvilket land vaccinationerne var foretaget i.

Figur 2. PMT titre 2 uger efter anden vaccination bestemt med VERO celle metoden

Diskussion

Under arbejdet med udforskningen af patogenesen for atrofisk rhinitis blev det opdaget, at visse stammer af bakterien Pasteurella multocida dannede en substans, der var toksisk overfor kulturer af EBL celler (Rutter & Luther, 1984 ), og det blev vist at serum fra immune dyr var i stand til at neutralisere denne toksiske effekt. Pennings & Storm (1984) viste, at den samme effekt kunne måles ved hjælp af VERO celle kulturer. Foged og medarbejdere (1988) udviklede en ELISA baseret på monoklonale antistoffer mod PMT og viste, at de kunne måle antistoffer i serum fra vaccinerede søer og deres grise (Nielsen og medarbejdere, 1991). Det blev også vist, at der var en statistisk sikker sammenhæng mellem titeren og beskyttelsen mod nysesyge (Sørensen og medarbejdere, 1992).

I de forløbne år har nogle laboratorier anvendt VERO celler eller EBL celler, mens andre har anvendt ELISA til bestemmelse af immunogeniciteten af vacciner mod nysesyge, men sammenligning af resultater fra sideløbende anvendelse af flere metoder har ikke været offentliggjort. De resultater, der er præsenteret i denne artikel viser, at der er vældig god overensstemmelse mellem de titre der blev opnået ved analyse af samme prøve i VERO celler og med ELISA. Det er desuden vist, at der er meget stor forskel på vacciners evne til at provokere dannelsen af antistoffer. Det er tydeligt, at vaccinen med olieholdig adjuvans (Porcilis AR-T) gav det højeste niveau af titre, og det blev også vist, at intervallet mellem vaccinationerne havde indflydelse på titerværdierne. Næsten samme titerniveau blev nået med vaccinen Atrinord DO. Denne vaccine indeholder dO-protein som antigen og aluminiumhydroxyd gel som adjuvans. dO-protein er et genetisk modificeret derivat af PMT, som er ugiftigt men fortsat immunogent (Petersen og medarbejdere, 1991). Efter vaccination dannes der antistoffer, der ikke kan skelnes fra antistoffer dannet mod PMT (Frandsen og medarbejdere, 1991). De andre vacciner, der er anvendt i denne undersøgelse, gav kun anledning til lave eller meget uregelmæssige titre. Årsagen til dette er ikke belyst, men kan muligvis skyldes lavt indhold af afgiftet PMT i vaccinerne.

Medarbejdere

Dr. Jesus Lopez, Intervet, Spanien har leveret serumprøver, dr. Guntram Paul , Intervet International, Holland har udført VERO celle testene og laboratorietekniker Gitte Juhl Funch, Intervet Scandinavia, har udført ELISA. Jeg takker alle for godt samarbejde.

Referencer

de Jong, M.F.,:Progressive and non progressive Atrophic rhinitis. In Straw, B., Dállaine, S. Mengeling, W.D., Taylor D.J., (Eds): Diseases of swine 8th ed. Blackwell Science, UK, 1999, pp. 355 - 384.

Foged, N.T.: Quantitation and purification of the Pasteurella multocida toxin by using monoclonal antibodies. Infect. Immun. 56: 1901-1906, 1988.

Foged, N.T., Nielsen,J.P. & Pedersen, K.B.: Differentation of toxigenic from nontoxigenic isolates of pasteurella multocida by enzymelinked immonosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 26: 1419-1420, 1988.

Frandsen, P.L., Foged, N.T., Petersen, S.K. & Bording, A.: Characterization of toxin from different strains of Pasterurella multocida serotype A and D. J. Vet. Med. B. 38: 345-352, 1991.

Kováes, F., Magyar, T.: Evaluation of Ingelvac AR4 vaccine under Field condition. Proc. IPVS Congress, Bologne, 1996, p. 354.

Nielsen, J.P., Foged, N.T., Sørensen, V., Barfod, K., Bording, A. & Petersen, S.K.: Vaccination against progressive atrophic rhinitis with a recombinant Pasteurella multocida toxin derivative. Can.J. Vet. Res, 55: 128-138, 1991.

Pennings, A.M.M.A.& Storm, P.K.: A test in vero cell monolayers for toxin production by strains of Pasteurella multocida isolated from pigs suspected of having atrophic rhinitis. Vet. Microbiol. 9: 503-508, 1984.

Pedersen, K.B. & Barfod, K.: Effect on the incidence of atrophic rhinitis of vaccination with a vaccine containing Pasteurella multocida toxin. Nord. Vet.-Med. 34: 293-302, 1982.

Petersen, S.K. & Foged, N.T.: Cloning and expression of the Pasteurella multocida toxin gene, toxA, in Escherichia coli. Infect. Immun. 57: 3907-3913, 1989.

Petersen, S.K., Foged, N.T., Bording, A., Nielsen, J.P., Riemann, H.K. & Frandsen, P.L.: Recombinant derivatives of Pasteurella multocida toxin: candidates for a vaccine against progressive atrophic rhinitis. Infect. Immun. 59: 1387- 1393, 1991.

Rutter, J. M. & Luther, P.D.:Cell culture assay for toxigenic Pasteurella multocida from atrophic rhinitis of pigs. Vet. Rec. 114: 393-396, 1984.

Sørensen, V., Barfod, K., Nielsen, J.P., Foged, N.T.: Effect degree of atrophy and serum antitoxin titer on the daily weight gain and feed conversion. Proc. IPVS Congress, Lausanne, 1992, p. 57.

Kilde: Dansk Veterinærtidsskrift nr. 20, 15. oktober 2000, 83. årgang side 17-18

Nysesyge hos svin - Pasteurella multocida toksin (PMT) titre bestemt ved ELISA og VERO celle metoden