Hvor stabil er fytase under forskellige lagringsforhold. I denne Grøn Viden præsenteres resultater fra et forsøg, der havde til formål at undersøge, hvor stabilt fytase er ved lagring, i forskellige tidsperioder og ved forskellige temperaturer.

Tilsætning af enzymet fytase til svine- og fjerkræfoder kan have stor praktisk betydning i bestræbelserne på at mindske udbringelsen af fosfor med husdyrgødningen.

Der er imidlertid stadig nogle uafklarede spørgsmål angående enzymet. Det vides fx ikke, hvor stabilt fytase er under forskellige lagringsforhold. I denne Grøn Viden præsenteres resultater fra et forsøg, der havde til formål at undersøge, hvor stabilt fytase er ved lagring, i forskellige tidsperioder og ved forskellige temperaturer.

Ud fra resultaterne opnået ved disse forsøg anses det for sandsynligt, at årsagen til de variationer, der ses ved gentagne målinger af fytaseaktivitet, skal findes i andre faktorer end lagringsforhold som temperatur og tid. Den væsentligste faktor, som influerer på forskellen i fytaseaktivitet fra måling til måling er øjensynligt, at det er vanskeligt at udtage repræsentative prøver af foder, hvor fytase er tilsat i form af pulver eller formalet granulat.
Ved opbevaring af foderprøver med fytase i mere end 2 måneder, hvilket kan være aktuelt i laboratoriet, anbefales det for en sikkerheds skyld, at foderet opbevares køligt eller på frost. Der er ikke noget, der tyder på, at formaling af foderet har nogen betydning for fytases lagringstabilitet.
I den korte periode foderet opbevares hos landmanden eller på foderstoffabrikken vurderes det, at temperaturen (i intervallet ÷ 20 til 25 °C) ikke har væsentlig betydning for stabiliteten af fytase. Dette er dog under forudsætning af, at foderet ikke udsættes for fugt.

Den fulde udgave af Grøn Viden - Husdyrbrug: "Mindre fosfor i husdyrgødning - undersøgelse af fytases stabilitet under lagring" kan hentes her som PDF.

Baggrund

Tilsætning af enzymet fytase til svine- og fjerkræfoder kan have stor praktisk betydning i bestræbelserne på at mindske udbringelsen af fosfor med husdyrgødningen.

Der er imidlertid stadig nogle uafklarede spørgsmål angående enzymet. Det vides fx ikke, hvor stabilt fytase er under forskellige lagringsforhold. I denne Grøn Viden præsenteres resultater fra et forsøg, der havde til formål at undersøge, hvor stabilt fytase er ved lagring, i forskellige tidsperioder og ved forskellige temperaturer.

Fytases rolle i fodringen af enmavede dyr

I kornbaserede foderblandinger er fordøjeligheden af fosfor ofte under 40-50%. Dette skyldes bl.a., at op til 80% af fosfor i plantefrø og kerner er bundet i salte af fytinsyre, se figur 1.

Fytinsyre er meget svært nedbrydeligt for enmavede dyr. Nedbrydningen af fytinsyre øges dog ved tilstedeværelsen af enzymet fytase, som katalyserer nedbrydningsprocesserne.

Figur 1. Fytat molekyle

Fytase er naturligt til stede i frø og korn i varierende mængder, afhængig af art og sort. Set fra plantens synspunkt er formålet med fytase at frigive fosfor, som omsættes og udnyttes under kornets/frøets spiringsproces. I dag fremstilles fytase også ved en bioteknologisk proces, og denne mikrobielle fytase kan tilsættes foderet for at øge fordøjeligheden af fytinsyre. Tidligere forsøg på Forskningscenter Foulum har således vist, at ved tilsætning af mikrobielt fytase, blev fosforfordøjeligheden hos svin forøget fra 40 til 58% i en bygbaseret foderblanding og fra 57 til 62-66% i en hvedebaseret foderblanding. Ingen af disse blandinger var varmebehandlet.

Ændringer i fytases aktivitetsniveau

Som for andre enzymer gælder det, at fytase aktiveres, når det omgives af et fugtigt miljø. I et fugtigt miljø afhænger fytinsyrenedbrydningen af temperaturen, og aktiviteten vil således være stigende ved stigende temperaturer. Dog vil enzymet blive denatureret ved meget høje temperaturer (fra 60ºC), hvorefter det mister sin aktivitet. På grund af denne risiko for denaturering bør fytase først tilsættes foderet efter en eventuel varmebehandling.

Da fytaseaktiviteten afhænger af procestemperaturen, er det muligt, at enzymets stabilitet ligeledes afhænger af den omgivende temperatur. En sådan forbindelse mellem temperatur og stabilitet vil have betydning for den fytaseaktivitet, der findes i foderet på foderstoffabrikken eller i det foder, der lagres hos landmanden.

Om der findes en sammenhæng mellem fytaseaktivitet og lagerforhold som temperatur og lagringstid er ikke hidtil blevet undersøgt. Laboratorierne har i nogle tilfælde analytiske problemer med at genfinde den tilsatte fytaseaktivitet. Baggrunden for disse laboratoriemæssige usikkerheder skal muligvis også findes i de forhold, som prøverne lagres under i laboratoriet.

På baggrund af disse formodninger blev der udført forsøg for at undersøge fytases lagringsstabilitet. Formålet med forsøget var dels at undersøge, om den tilsatte mængde fytase kan genfindes ved analyse, og dels at undersøge, hvor stabil fytaseaktiviteten er under lagringsforhold, eksempelvis i forbindelse med temperatur og tid. Resultaterne fra forsøget vil kunne anvendes som et led i optimering af den kemiske analyse af fytaseaktivitet og samtidig give nyttige informationer om nogle af de forhold, man skal være opmærksom på ved lagring af foder indeholdende fytase.

Forsøgsbeskrivelse

Som fodertype anvendtes en almindelig kendt slagtesvineblanding baseret på byg (90% tørstof (TS)).
Der anvendtes fytase fra to firmaer, fytase 1 og fytase 2.
Foderblandingen blev tilsat tre forskellige niveau af fytase (0, 250 og 500 FTU/kg foder), i alt 5 blandinger.
De 5 blandinger blev hver delt op i 6 mindre portioner, som blev lagret ved fire forskellige temperaturer (lagertemperatur, stuetemperatur, på køl og på frost).
Alle prøverne blev analyseret straks efter, at de var blandet (tid = 0) samt 7, 14, 28, 56 og 84 dage efter blanding. Prøverne blev analyseret umiddelbart efter, at de blev hentet fra oplagringsstedet.
Prøverne blev formalet umiddelbart før analysen til hver analysedato.
Der blev gemt en formalet prøve fra hver af de 5 blandinger til tiden 0, som blev opbevaret på frost (”0-prøver”). Disse ”0-prøver” blev analyseret til hvert tidspunkt som et mål for, om det har nogen betydning, at foderet er formalet under lagringen. For ”0-prøverne” gjaldt, i modsætning til de andre foderprøver, at der blev udtaget prøve fra de samme foderprøver ved hver analysedato.
Forsøget forløb i perioden september til november. De fire lagringstemperaturer svarede til 14-22 °C, 20 °C, 5 °C og ÷ 20 °C, for henholdsvis lager, stue, køl og frost.

De to typer fytase

Begge fytasetyper blev tilsat foderet i pulverform. Fytase 1 var i pulverform, hvorimod fytase 2 blev indkøbt som granulat, og derefter formalet til pulver i en morter inden opblanding i foderet. Ifølge deklarationen på fytase 1 var aktiviteten minimum 5000 FTU/g, hvorimod den for fytase 2 var angivet som den aktuelle aktivitet i sendingen (3352 FTU/g). Fytase 1 blev tilsat i mængder, der svarede til, at den aktuelle aktivitet var lig med 5000 FTU/g. Der blev således tilsat hhv. 125 og 250 mg fytase 1 og 187 og 374 mg fytase 2 til 2,5 kg foder for at opnå foderblandinger med en fytaseaktivitet på hhv. 250 og 500 FTU/kg foder.

Analyser

Der blev målt fytaseaktivitet i alle prøver til de nævnte tidspunkter. Desuden blev mængden af fytinsyre bestemt i prøverne ved forsøgets start samt ved forsøgets slutning (dag 0 og 84).

Fytaseaktivitet blev bestemt ved at tilsætte en eksakt mængde fytinsyre til prøven og derefter bestemme den mængde orthofosfat, der fraspaltes af fytase i prøven. Den dannede orthofosfat blev bestemt spektrofotometrisk ved 415 nm efter dannelse af farvet kompleks med molybdatvanadatreagens.

Fytinsyre blev bestemt ved at fælde fytinsyre i prøven med overskud af ferriioner i surt miljø. Overskuddet af ferriioner efter fældning blev bestemt spektrofotometrisk ved 519 nm efter dannelse af en farvet forbindelse mellem ferriioner og 2,2’-bipyridin. Fytinsyreresultatet blev opnået som differens mellem den oprindelige koncentration af ferriioner tilsat prøven og den målte koncentration efter fældning af fytinsyre.

Foderets indhold af fytinsyre

Foderets fytinsyreindhold var 3,0 g/kg TS, hvilket var uforandret over lagringsperioden på 3 måneder. Dette viser, at den potentielle fytaseaktivitet ikke er gået i gang under lagringen.

Den aktuelle fytaseaktivitet i prøverne

For alle prøverne gjaldt, at den tilsatte fytaseaktivitet var højere end den forventede mængde, se tabel 1. Dette viser, at den mikrobielt producerede fytase i begge produkter indeholder mindst den deklarerede fytaseaktivitet. Der er en tendens til, at fytaseaktivitet i fytase 1 er lidt højere end i fytase 2, hvilket blot er et resultat af, at der for fytase 1 var angivet aktiviteten som et minimum, hvorimod fytaseaktiviteten i fytase 2 var angivet som den specifikke aktivitet.

Tabel 1. Den gennemsnitlige totale fytaseaktivitet i foderet (fundet ved kemisk analyse), tilsat mikrobielt fytase (beregnet) og afvigelse fra den forventede mængde (hhv. 250 og 500). Tallene repræsenterer et gennemsnit af 35 prøver (7 tidspunkter og 5 lagringstemp.). Fytaseaktivitet er angivet som FTU/kg TS

<>

		------- Fytase 1 -------		------- Fytase 2 -------
	0	250	500	250	500
Total fytaseaktivitet	104	480	826	420	767
Tilsat fytase	0	376	722	316	663
Afvigelse fra forventet	0	+126	+222	+66	+163
(1 FTU = den mængde enzym, der frigør 1 mmol orthofisfat pr. minut under følgende testbetingelser: pH 5,5, 3 °C, 0,0061 M natriumfytat)

Figur 2a.

Figur 2b.

Ændringer i fytaseaktivitet

Figur 2 viser udviklingen af fytaseaktiviteten i alle prøver over de 3 måneder, hvor forsøget stod på. Ud fra figuren er der tilsyneladende ingen systematisk ændring af aktiviteten over tid. Det naturlige fytase ser umiddelbart ud til at være det mest stabile under alle 4 lagringstemperaturer (se figur 2b). I prøverne, hvor der er tilsat fytase varierer aktiviteten betydeligt, dog afhænger variationen tilsyneladende hverken af lagringstemperatur eller tid.

Forklaringen på variationerne kan måske findes i analysen af fytase. Der er muligvis en større analysesikkerhed på bestemmelsen af den naturlige fytase sammenlignet med den mikrobielt producerede fytase. En mere sandsynlig forklaring ligger dog nok i fordelingen af den tilsatte fytase i foderet.

Som allerede nævnt blev der tilsat fra 125 til 374 mg pulveriseret fytase til 2,5 kg foder. Det er altså meget små mængder blandet op i en forholdsvis stor mængde foder. Ved udtagning af prøver på 1-2 g til den kemiske analyse (efter formaling, er der således stor sandsynlighed for, at prøven ikke er repræsentativ for hele foderblandingen.

Til trods for, at der ikke ses nogen klar sammenhæng mellem lagringstemperatur og fytaseaktivitet i prøverne, er det bemærkelsesværdigt, at fytaseaktiviteten efter 3 måneders lagring er højest i prøverne, som har været opbevaret på frost eller på køl sammenlignet med de prøver, som blev opbevaret ved ca. 20ºC (stue og lager). Næsten alle prøverne, der var tilsat 250 eller 500 FTU/kg havde efter lagring i 84 dage stadig en fytaseaktivitet, der var højere end det forventede niveau.

Figur 3 repræsenterer udviklingen i fytaseaktivitet i de prøver, der var formalet i hele lagringsperioden, hvor de blev opbevaret på frost. Også for disse prøver ser man, at længden af lagringsperioden ikke har nogen indflydelse på den fytaseaktivitet, der findes i prøverne. Der er således intet der taler imod, at laboratorierne formaler prøverne og opbevarer dem på frost indtil analysetidspunktet. I hvert fald inden for en periode på 3 måneder.

Figur 3.

Konklusion

Ud fra resultaterne opnået ved disse forsøg anses det for sandsynligt, at årsagen til de variationer, der ses ved gentagne målinger af fytaseaktivitet, skal findes i andre faktorer end lagringsforhold som temperatur og tid. Den væsentligste faktor, som influerer på forskellen i fytaseaktivitet fra måling til måling er øjensynligt, at det er vanskeligt at udtage repræsentative prøver af foder, hvor fytase er tilsat i form af pulver eller formalet granulat.
Ved opbevaring af foderprøver med fytase i mere end 2 måneder, hvilket kan være aktuelt i laboratoriet, anbefales det for en sikkerheds skyld, at foderet opbevares køligt eller på frost. Der er ikke noget, der tyder på, at formaling af foderet har nogen betydning for fytases lagringstabilitet.
I den korte periode foderet opbevares hos landmanden eller på foderstoffabrikken vurderes det, at temperaturen (i intervallet ÷ 20 til 25 °C) ikke har væsentlig betydning for stabiliteten af fytase. Dette er dog under forudsætning af, at foderet ikke udsættes for fugt.

******

Grøn Viden indeholder informationer fra Danmarks JordbrugsForskning.

Grøn Viden udkommer i en mark-, en husdyr- og en havebrugsserie, der alle henvender sig til konsulenter og interesserede jordbrugere. Abonnement tegnes hos Danmarks JordbrugsForskning Forskningscenter Foulum Postboks 50, 8830 Tjele Tlf. 89 99 10 10 / www.agrsci.dk

Prisen for 2000: Markbrugsserien kr. 210, husdyrbrugsserien kr. 150 og havebrugsserien kr. 125.

Anders Correll (ansvarshavende redaktør)
ISSN 0903-0719