Der er udført en række forsøg for at påvise, om den kombinerede effekt af lavt pH, specifikke organiske syrer og konkurrencefloraen i vådfoder kan eliminere salmonella.

Der er udført en række forsøg for at påvise, om den kombinerede effekt af lavt "pH", specifikke organiske syrer og konkurrencefloraen i vådfoder kan eliminere salmonella.

I et buffersystem kan opnås en eliminering af 104 salmonella i løbet af 2 timer ved et pH på ca. 4. Hertil kræves 0,7 % myresyre, eller 3 % propion- eller myresyre. Der kan ikke konstateres nogen væsentligt forbedret effekt ved blanding af organiske syrer.

Ved løbende tilsætning af naturligt inficeret råvare til vådfoder i pilotsystem ved pH 4,1, 4,3 og 4,5 kan ikke konstateres nogen tydelig drabseffekt. Dette kan have sammenhæng med, at podeniveauet var lavt, således at et tydeligt drab ikke kunne detekteres. Der er indikation på et højere indhold af salmonella i de tilfælde, hvor pH har været over 5.

Den nødvendige mængde myresyre, der skal tilsættes foderet for at nå et ønsket pH, er afhængig af den naturlige fermentering, ligesom det omvendte også er tilfældet. I en blanding med 25 % tørfoder og 75 % vand uden naturlig gæring er fundet en nødvendig dosering på ca. 1,4 promille myresyre. Ved løbende tilsætning til pilotvådfodersystemet i drift er set variationer i den nødvendige dosering på 0,4-l,7 promille ren myresyre for at opnå pH 4,5. Denne variation må i noget omfang skyldes variationer i den mikrobielle syredannelse.

Måling af drabsvirkningen i vådfoder ved pH 5,0, 4,5, 4,2 og 4,1 viste, at der ikke kunne konstateres et egentligt drab af salmonella i løbet af 3 timer. Men for forsøgsled med pH under 4,5 sås i de fleste tilfælde en kraftig reduktion af ubeskadigede salmonella, der kan vokse frem på en selektiv agar. Variationen i drabseffekten kan ikke udelukkende forklares ved blandingens pH. Andre faktorer, der muligvis kan bidrage til drabsvirkningen, er den tilstedeværende mikroflora og dens produktion af bakteriehæmmende stoffer. Indflydelse af sammensætningen af det anvendte vådfoder kan heller ikke udelukkes.

Baggrund

Salmonellabakterier i svin er en væsentlig kilde til kontamination af svinekødet med denne patogene bakterie. De fleste større svinebesætninger anvender vådfoder, hvilket giver mulighed for at anvende billige biprodukter eller andre råvarer. Disse råvarer er imidlertid ikke altid underkastet det krav om salmonellafrihed, der gælder for industrielt behandlet indenlandsk foder. Specielt direkte importerede proteinråvarer er en mulig kilde til salmonellakontamnation i besætningen.

Formålet med projektet er at undersøge mulighederne for at eliminere tilførte salmonella i et vådfodringsanlæg. Salmonelladrab opnås ved et lavt pH, dels gennem den ved fermentering dannede mælkesyre, dels ved tilsætning af syrer (organiske og/eller uorganiske). Det undersøges, om de anvendte tilsætninger har nogen åbenbar skadelig virkning pa mikrofloraen i systemet.

Jay (1986) angiver følgende minimums-pH-grænser for vækst afhængig af syretype: Saltsyre: 4,05; mælkesyre: 4,40; eddikesyre: 5,40; propionsyre: 5,50. Da bufferkapaciteten i mediet ikke er kendt, kan ikke omregnes direkte til syreindhold.

Cherrington et al. (1991) fandt, at 0,5-0,7 mol/l myresyre ved pH 5 er i stand til dræbe salmonella i flydende kulturer. Den nødvendige tid til 90 % reduktion (d-værdi) var 36-48 min. for propionsyre og 4,3-8,5 t for myresyre. En koncentration på 0,5 mol/l svarer for myresyre til 2,3 %, for propionsyre til 3,7 % ren syre.

Når Sal. typhimurium udsættes for lavt pH med saltsyre, ses en reduktion i løbet af 180 min. på 90% (1 logaritmeenhed) ved pH 3,8 og på 99,999 % (5 logaritmeenheder) ved pH 3,3. Ved pH 4,3 ses praktisk taget intet drab i løbet af 180 min. Drabet er tilnærmet logaritmisk (Foster, 1991).

Salmonellabakteriernes resistens overfor syre er afhængig af den behandling, som de forudgående har været udsat for. Humphrey et al. (1993) refererer en række forfattere for, at forskellige stresseksponeringer (base, sult) beskytter bakterierne mod efterfølgende drabsfaktorer (varme, brintperoxid). Humphrey et al. (1993) finder, at Sal. enteritidis, fagtype 4 dyrket ved 20 °C, opnår en 3,5 x forøgelse af resistensen mod pH 2,6 efter eksponering ved 45 °C i 5 min. Effekten er ikke afhængig af proteinsyntese.

Foster (1993) finder, at der formodentlig eksisterer i hvert fald tre forskellige mekanismer af betydning for syreresistensen hos Sal. typhimurium. Det ene er et konstitutivt (stedsevarende) system, der funderer ned til ca. pH 4. Det kræver ikke proteinsyntese og fungerer sandsynligvis via den fysiologisk kontrollerede pH-kontrolmekanisme, der inkluderer Na⁺/H⁺ og K⁺/H⁺-bærere. Den anden mekanisme kaldes syre-tolerance-respons og kan beskytte cellerne under pH 4 (i forsøget pH 3,3), men ikke ved langvarig påvirkning af pH 4,3; den opnås ved inkubering i en time ved pH 5,8 og er afhængig af proteinsyntese. Endelig findes syrechock-mekanismen, hvor et skift direkte fra neutrale omgivelser til et pH under 4,5 (i forsøget 4,3) inducerer en række ændringer i organismens syntese. Denne mekanisme ses ikke at have væsentlig effekt på overlevelsen ved pH 3,3. Foster 's forsøg har ikke fastlagt pH-grænserne for de forskellige mekanismer.

Resistensen er udtrykt i D-værdier, hvilket forudsætter, at det logaritmiske drab er lineært.

Diskussion

Forsøg 1

Det ses, at i det anvendte buffersystem kræves høje koncentrationer af syrer for et tilstrækkeligt salmonelladrab, 0,7 % myresyre, 3 % propionsyre eller eddikesyre. Der var kun lille effekt af det oprindelige pH i bufferen, idet der i alle tilfælde først blev opnået effektivt drab ved et pH omkring 4,0. Da det effektive pH ligger lavere, jo lavere udgangs-pH har været, tyder det på en effekt af de organiske syrer ud over pH-virkningen (det oprindelige pH i bufferen er indstillet med HCl). Virkningen skal ses som en kombination af det opnåede pH og koncentrationen af organisk syre, og en given koncentration af organisk syre vil bringe pH til et lavere niveau, når udgangsniveauet er lavere.

De fundne syrekoncentrationer og pH er betænkelige ud fra en økonomisk og sundhedsmæssig synsvinkel. Ifølge litteraturen skal en kombination af forskellige organiske syrer give større effekt. Som det fremgår af tabel 7, er der ingen indikationer på, at tilsætning af propion- eller eddikesyre kan reducere den nødvendige mængde myresyre i et tilstrækkeligt omfang. Ligeledes er alle de effektive pH under 4,0.

Forsøg 2

Forsøgsbeholderne blev indstillet på det valgte pH en gang pr. dag. Målingerne viser, at mellem disse indstillinger var store svingninger. I forbindelse med nyblanding af foder steg pH 0,51 pH-enhed. Denne stigning blev kun reguleret ned ved den ene fodring. pH efter henstand natten over var dog oftest pa det ønskede niveau. Efter henstand natten over var pH i kontrolbeholderen uden syretilsætning ikke væsentlig forskellig fra forsøgsbeholderne. Dog ses nogle få forsøgsdage et meget højt pH i denne beholder.

Der fremgår ikke nogen tydelig sammenhæng mellem det konstaterede pH og forekomst af salmonella. I beholder 2 og specielt 1 ses en forøget forekomst nogle få dage efter et påfaldende højt pH. I de øvrige beholdere er de påviste indhold lave.

Forholdet kan muligvis forklares ved, at de normalt forekommende pH kun medfører et ringe salmonelladrab. Ved de høje pH (5,6-6,0) sker en opformering af salmonella, og de høje tal for salmonella vil persistere i nogle dage, indtil de er dræbt eller fortyndet ud.

Generelt er kun fundet få salmonella i vådfoderet. Dette skyldes, at salmonella i det anvendte tørfoder blev reduceret til et lavt niveau i forsøgstiden.

Registreringerne viste, at der ikke er en simpel sammenhæng mellem udgangs-pH og den syremængde, der skal tilsættes for at opnå et givet pH-fald. Den fundne sammenhæng kan kun betragtes som vejledende, og vil under alle omstændigheder være afhængig af foderets sammensætning, tørstofindhold m.m. Ud fra formlen kan beregnes, at der ikke opnås et pH-fald, hvis det oprindelige pH er 3,83 eller derunder. Denne værdi er i god overensstemmelse med myresyrens pH-værdi, 3,75, der kan opfattes som det pH, hvor stoffet ikke længere har en netto syrevirkning.

Forsøg 3

Med løbende tilsætning af syre ses også ret store svingninger i foderets pH. I alle beholdere med tilsat syre har pH stort set kunnet holdes under 4,8. Kontrolbeholderen ligger generelt højere end beholdere med syretilsætning.

Der er en uoverensstemmelse mellem forsøg 2 og 3 med hensyn til de nødvendige syremængder til reduktion af pH, idet det f.eks. for at nå pH 4,5 i forsøg 2 var tilstrækkeligt med 0,7 promille myresyre, mens 2,4 promille var nødvendigt i forsøg 3. Forsøg med tilsætning af syre henholdsvis i tør- og vådfoderet (tabel 12) viser, at 30 min. efter opblanding af foderet fås ingen væsentlig forskel mellem de to metoder til syretilsætning. Foderblandingen var ens i de to forsøg.

Forskellen i nødvendig syredosering kan have sammenhæng med, at de konstaterede kimtal (mælkesyrebakterier) er væsentligt lavere i beholdere med syretilsætning i forsøg 3 end i forsøg 2 (tabel 10 over for tabel 13). En mindre mikrobiel aktivitet betyder en mindre produktion af mælkesyre. Temperaturen ligger 4° højere i forsøg 3 end i forsøg 2, uden den dog har nået et niveau, hvor der kan forventes en hæmning af floraen. Ud fra temperaturen forventes derfor en højere aktivitet i forsøg 3 end i forsøg 2, i modsætning til de konstaterede resultater.

Supplerende forsøg, der er refereret i bilag 2, viser, at i en blanding af vand og tørfoder vil en tilsætning på 2 promille myresyre sænke pH til ca. 4,3.

Disse resultater viser, at det er umuligt at anbefale en given syredosering, hvis formålet er at opnå et bestemt pH. I praksis vil det opnåede pH-fald afhænge af fodersammensætning, blandingsforhold m.v. Derudover viser disse resultater, at små udsving i den naturlige fermentering har stor indflydelse på det opnåede pH. En løbende registrering af pH er eneste mulighed for at kontrollere, om foderet har nået det ønskede pH.

Mod forventning skete en relativt hurtig uddøen af salmonella i de naturligt inficerede rapskager. Podeniveauet i forsøg 3 er derfor blevet så lavt, at det ikke er relevant at tale om drab, idet det tilsatte antal er tæt på metodens detektionsgrænse. Forsøgene viser dermed, at der generelt ikke er vækst af salmonella i vådfodersystemet ved de anvendte pH. I kontrolbeholderen på dag 4 blev fundet et ret højt salmonellaindhold. De stemmer overens med, at der i denne beholder var et højt pH (ca. 5,2) efter nyblanding.

Der er ikke nogen umiddelbar forklaring på det ekstremt høje fund ved sidste udtagning i beholder 3. En mulighed er, at salmonella er uens fordelt i foderet, til trods for at det er formalet. Såfremt der findes partikler med et ekstremt højt antal salmonella, vil disse ikke afsløres ved MPN-metoden, men hvis partiklen opløses, og bakterierne spredes i vådfoderet, kan det give anledning til ekstremt høje tal. En salmonellakultur kan indeholde ca. 10 exp 8 kim/g. Med de anvendte mængder og fortyndinger vil en partikel på 0,25 mg i de 500 g tørfoder indeholde så mange salmonella, at de fundne antal kan opnås ved simpel opløsning og spredning i vådfoderet.

Forsøg 4 - naturlig podning

I visse forsøgsled, podet med rapskager, er salmonellaniveauet så lavt, at der ikke kan konstateres et sikkert drab (besætning 1, pH 4,2. I forsøgsled podet med bomuldsfrøkager (pH 4,1) er salmonellaindholdet så højt, at mange resultater ligger over detektionsgrænsen.

Kun i et enkelt tilfælde er opnået en acceptabel drabskurve, nemlig i besætning 2, pH 4,1, uden tilsætning, hvor der er opnået et drab på ca. 10 gange i løbet af 60 min. De øvrige forsøgsled i samme hold viser ikke en reduktion. Dette kan skyldes den tidligere nævnte uens fordeling af salmonella i podematerialet.

For de øvrige undersøgte kombinationer af vådfoderleverandør, udgangs-pH og tilsætninger kan ikke konstateres noget tydeligt drab.

Podning med renkultur

Salmonellabestemmelser ved titer viser ingen reduktion af salmonellaindholdet under de undersøgte forhold. Derimod ses en reduktion gennem de undersøgte 180 min., når salmonellaindholdet måles ved direkte udsæd på Rambach Agar. Ved variansanalyse af de fire forsøgsled separat, er i et tilfælde (pH 4,4) fundet, at der var signifikant lavere salmonellakimtal med end uden syretilsætning, og der er signifikante forskelle mellem syrerne. Disse resultater har ikke kunnet bekræftes i de andre forsøgsled. I tre ud af fire forsøgsled fås en signifikant virkning af tiden, idet længere virketid giver lavere kimtal.

Ved bakteriedrab forventes, at logaritmen til kimtallet er lineær i forhold til virketiden. Da kurverne ikke umiddelbart ser rette ud, er der i forbindelse med den lineære regression testet, om punkternes manglende tilpasning til kurven er signifikant . Dette er kun tilfældet i et tilfælde (pH 4,4). Alligevel giver en test for signifikant virkning af et andengradsled i regressionen signifikans i to tilfælde. På grund af materialets inkonsistens kan der ikke drages konklusioner, mht. om drabet kan beskrives ved en ret linie.

Analysen for salmonella ved hjælp af titer (bestemmelse af den yderste positive tifoldsfortynding) er udført efter samme procedure som analysen ved naturlig kontaminering. Denne analyse sikrer, at salmonella detekteres, selv om de er "sublethalt beskadiget", dvs. beskadigede, men ikke døde. Ved udsåning direkte på en selektiv agar som Rambach Agar, kan man kun forvente, at bakterier i fuld vitalitet kan vokse frem. Forskellen mellem bestemmelserne ved titer og på Rambach agar kan derfor forklares ved, at hovedparten af de tilsatte salmonellabakterier er syrebeskadigede, men ikke døde.

Betydningen af en syrebeskadigelse for bakteriernes evne til at inficere svin er ikke kendt, men det forekommer sandsynligt, at beskadigede bakterier har vanskeligere ved at overleve passagen gennem maven og manifestere sig i tarmsystemet. Undersøgelser over syrepåvirkningens betydning for Sal. typhimuriums overlevelse ved ekstremt lavt pH (3,3 som i maven) viser, at resistensen forøges, hvis bakterierne vokser ved pH 5,8, men ikke ved inkubering ved pH 4,3 (Foster, 1991). Ud fra disse resultater er det meget væsentligt, at der ikke opstår et pH i foderet omkring 5,8, idet det vil give anledning til vækst af salmonellabakterier, som har en ekstrem modstandsdygtighed mod det lave pH i maven.

Reference
-	Cherrington, C.A.; Hinton, M.: Pearson, G.R.; Chopra, I., 199l: Short-ehain organie aeids at pH 5.0 kill Esehericia coli and Salmonella spp. without causing membrane perturbation. J.Appl. Bact. 70, 161-165.
-	Jay, J.J., 1986: Modern Food Mierobiology 3.ed. Van Nostrand Reinhold Company Inc.
-	Foster, J.W., 1991: Salmonella acid shock proteins are required for the adaptive acid toleranee response. J.Bact. 173(21), 6896-6902.
-	Humphrey, T.J.; Richardson, N.P.; Statton, K.M.; Rowbury R.J., 1993: Effects of temperature shift on acid and heat tolerance in Salmonella enteritidis Phage Type 4. Appl. Env. Mierob. 59(9), 3120-3122.

Kilde:

Forsøgsrapport, 1994. Bioteknologisk Institut, Holdbergsvej 10, 6000 Kolding. Tlf. 75520433

Salmonelladrab i vådfoder