Æg-testen er en biologisk test, hvor kyllingefostre reagerer på injiceret materiale. På grundlag af dødeligheden efter 6 dages inkubation kan den injicerede prøves toxicitet vurderes.

Æg-testen er en biologisk test, hvor kyllingefostre reagerer på injiceret materiale. På grundlag af dødeligheden efter 6 dages inkubation kan den injicerede prøves toxicitet vurderes.

I nærværende projekt er æg-testen forsøgt udviklet til praktisk anvendelse i foderstofsektoren, specielt med henblik på foderets fedtfraktion. Forskellige problemer vedrørende infektion, ekstraktion, injektion og oxidation er blevet løst i løbet af projektet. På nuværende tidspunkt må man imidlertid erkende, at grundlaget for praktisk anvendelse af æg-testen i form af sikre korrelationer mellem testen og foderets fedtkvalitet ikke er til stede.

Der er dog grundlag for en begrænset anvendelse under kontrollerede forhold som f.eks. forskningsprojekter, råvareanalyse i specielle tilfælde etc.

En videre udvikling af testen må vurderes som værende kostbar, og resultatet er ikke sikkert.

Baggrund

Der har i de senere år været et voksende behov for metoder til vurdering af foderkvalitet. Gammelkendte mål som råprotein, råfedt og vand er ikke i sig selv tilstrækkelige til at garantere for et faders kvalitet, og de nyere supplerende analyser - som f.eks. FFA-tal og peroxidtal - gør nok en vurdering mere pålidelig, men giver heller ikke fuld sikkerhed.

Et fodringsforsøg er således stadig den eneste test, der kan vurdere foderkvalitet tilfredsstillende. Begrænsningerne for en øget anvendelse af fodringsforsøg er omkostningerne og tiden, der går, inden resultaterne foreligger.

Det er derfor nødvendigt at råde over et program af analyser, der på kort tid giver praktisk anvendelige oplysninger til en rimelig pris.

Bioteknisk Institut har i mange år arbejdet på at udvikle et sådant analyseprogram, der spænder fra traditionelle rutineanalyser til helt nyudviklede analyser. Langt de fleste er kemiske analyser, der udmærker sig ved specifik måling af enkelte indholdsstoffer, f.eks. glucose. En generel bedømmelse af foderet kræver derfor mange forskellige analyser.

Et alternativ er en biologisk test. En sadan er ikke så specifik som kemiske analyser, men giver udslag for mange faktorer samtidigt og kan derved give en slags totalvurdering af foderet. Et fodringsforsøg er et eksempel på en biologisk test.

Æg-testen, som nærværende projekt har undersøgt, kan betragtes som et fodringsforsøg i meget lille skala. Fordelene ved dette er bl.a. hurtigere og billigere resultater i forhold til f.eks. tilvækstforsøg med kyllinger.

Æg-testens princip samt de indledende undersøgelser i 1977 er beskrevet i appendiks.

Til gennemførelse af projektet har Bioteknisk Institut modtaget støtte fra Teknologirådet. For den givne bevilling beder man Teknologirådet modtage en hjertelig tak.

Diskussion

I denne diskussion er fremdraget de væsentlige aspekter i projektet. En detaljeret diskussion af samtlige forsøg og deres indbyrdes forhold er undgået, idet den ville blive helt uoverskuelig. Der henvises i stedet til beskrivelserne Af de enkelte forsøg i afsnit III med tilhørende betragtninger.

Infektion

I starten af projektet opstod der infektionsproblemer med ski mm el og bakterier i æg gene under inkubationen. Det var særlig udtalt ved injektion af fedt, der var ekstraheret fra foder, mens vegetabilske olier og rene stoffer, som f.eks. propylenglycol, gav anledning til færre tilfælde. Dette kunne tyde på, at kilden til infektion måtte ligge hos det injicerede materiale, og ikke i fremgangsmåden ved udførelsen af æg-testen. Imidlertid havde man forventet, at ekstraktionsproceduren ville sterilisere fedtprøven, som det var erfaret i de tidligere forsøg, der var beskrevet i appendiks. Det viste sig ikke at være tilfældet. Med baggrund i de nu udførte forsøg måtte årsagen til, at infektionsproblemet ikke forekom tidligere, være, at inkubationstiden dengang var meget kort (3 dage), og ikke at ekstraktionen steriliserede prøven.

Løsningen på det aktuelle problem blev da en sterilisering af prøven, som beskrevet i afsnit II.4. med antibiotika. i løbet af forsøgene 1-13 blev det konstateret, at fungilin, penicillin og streptomycin alle var nødvendige for at hindre infektion i løbet af en 6 dages inkubationsperiode. Ingen af de tre antibiotika var toxiske i sig selv, og tilsætningen af dem påvirkede derfor ikke forsøqsresultaterne. Anvendelse af antibiotika har således fungeret tilfredsstillende uden bivirkninger.

Injektion

I de tidligere forsøg, der var beskrevet i appendiks, blev injektionen foretaget på l. inkubationsdag. Fostrets placering blev konstateret ved gennemlysning, og injektionen foretaget "lodret" i den modsatte side af ægget. I de efterfølgende forsøg foretages injektionen, før æggene blev inkuberet. Fostrets placering kunne ikke erkendes på dette udviklingestadium, og injektionen blev da blot foretaget "lodret". Dette viste sig at medføre mange utilsigtede dødsfald, hvilket blev sikkert bekræftet i forsøg 6. Årsagen var, at fosterkimen blev beskadiget ved injektionen, som beskrevet i forsøg 8. En alternativ "vandret" injektion blev afprøvet i forsøg 9 og viste sig at fungere fuldt tilfredsstillende, idet den ikke forårsagede ekstra dødsfald. Samtidigt blev en kanyle, der havde mindre diameter end hidtil anvendt, afprøvet. Der var ingen forskel i dødelighed mellem de to kanyler, der havde ydre diameter på henholdsvis 0,80 og 0,45 mm . Derimod var den tykkeste kanyle lettere at presse fedtet gennem under injektionen, og den blev derfor fortsat anvendt.

I forbindelse med injektionen var det nødvendigt at lave et hul i æggeskallen. De første forsøg omfattede slibning af et 1 cm² stort hul over luftblæren og, efter injektion, tilklæbning med klar tape. Dette havde den fordel, at fostrets udvikling kunne iagttages under hele inkubationsperioden. Til gengæld forøgedes chancen for luftbåren infektion samtidigt med, at slibningen gav temmelig mange rystelser. Da det endvidere var ret arbejdskrævende, blev denne procedure forladt til fordel for den tidligere anvendte med brug af tandlægebor. Sidstnævnte metode fungerede tilfredsstillende i de forsøg, hvor metoden blev anvendt (forsøg 3-24).

Aflatoxin B₁

Som kontrol af de leverede rugeægs kvalitet blev deres responser over for aflatoxin B₁ målt. Mange faktorer spiller ind på dette område, bl. a. hønsenes race, fodring og alder. For at sikre, at æggenes individuelle vægtforskelle ikke bevirkede en uønsket spredning på resultaterne blev de største og mindste æg frasorteret før æg-testen.

Forsøg 4 viser de samlede resultater med ren aflatoxin B1. De konstaterede dødeligheder er sammenlignelige med publicerede resultater (5). Forsøg 11, med toxinholdige foderstoffer, giver resultater for æg-testen, der er samm enlignelige med tilsvarende målinger baseret på tyndtlagschromatografi. Sammenfattende må det derfor formodes, at æggene, der er anvendt i dette projekt, har været typiske med hensyn til respons over for indiceret toxin.

Ekstraktion

En væsentlig forudsætning for, at æg-testen kunne bestemme fedtkvaliteten i foder, var, at fedtet kunne ekstraheres. For "sundt" fedt stod der mange ekstraktionsprocedurer til rådighed, hvorimod meget få metoder til ekstraktion af oxideret fedt m.m. var beskrevet.

Indtil forsøg 12 blev ekstraktionen af foderfedt udført med en blanding af metanol, vand og hexan. Fordelen ved dette var, at man efter ekstraktionen havde to faser, hvoraf metanolvand-fasen ville indeholde en betydelig del af eventuelle mycotoxiner i foderet, mens hexanfasen ville indeholde fedtiraktionen. Man kunne således foretage en samtidig ekstraktion, hvilket var økonomisk fordelagtigt. Imidlertid viste det sig i forsøg 16, at hexan var uegnet til at opløse oxideret fedt. Derimod var en blanding af chloroform og metanol, som den eneste af 11 afprøvede opløsningsmidler, i stand til at opløse det oxiderede fedt hurtigt og ved tilstedeværelse af vand.

Derfor blev der i de resterende forsøg med foderfedt anvendt chloroform:metanol som ekstraktionsmiddel. En ulempe ved chloroform:metanol var, at den ekstraherede for effektivt. Såvel glyco- og phospholipider, som en række andre stoffer, ekstraheres med, og ved inddampning dannedes der et bundfald i fedtfasen, som vanskeliggjorde injektion. I forsøg 22 forsøgtes en fracentrifugering efter inddampning, og dette blev i forsøg 24 ændret til udfældning i en blanding af chloroform, metanol og hexan efterfulgt af centrifugering før inddampning. Denne fremgangsmåde syntes at være mere uafhængig af fedthasen, idet bundfaldsdannelsen foregik inden inddampningen.

Det bemærkes, at ved anvendelse af sidstnævnte metode var dødeligheden ved injektion af fedt fra byg og forblandinger lille, mens foderfedt tidligere havde forårsaget en ret høj dødelighed. Der er derfor en mulighed for, at det bundfældede materiale har indeholdt det toniske princip, der har gjort alle tidligere foderfedtprøver ret toxiske.

Oxidation

Æg-testens forventede anvendelse var som indikator for toxiske fedtharskningsprodukter i foder, herunder oxidationsprodukter. Dette område af foderstofanalyserne besværedes af manglen på kontante metoder, hvilket bl.a. var årsag til projektets iværksættelse.

Dette betød igen, at for at kunne korrelere ægtesten til fedtkvaliteten, måtte denne kunne bestemmes på andre måder end FFA-, peroxid- og anisidintal, som hidtil var anvendt, og som ind imellem havde vist deres utilstrækkelighed.

Til det formål blev iltforbruget ved oxidationen valgt som parameter for oxidationens forløb. Dette iltforbrug blev målt volumetrisk og omregnet til mg ilt pr. g prøve for at kunne sammenligne de enkelte forsøg.

Det skal bemærkes, at enhver ændring i partialtrykket for f.eks. vand eller kuldioxid ville blive registreret som større eller mindre iltforbrug ved de udførte målinger. Målingerne bør da betragtes som retningsgivende, men ikke misvisende, idet enkelte kontrolmålinger efter oxidation viste omkring 100%. ilt i oxidationskolben.

Oxidationen blev i næsten alle tilfælde fremskyndet ved bestråling med synligt lys. Dette kunne medføre, at de dannede oxidationsprodukter var forskellige fra de i praksis forekommende. Derfor blev der i forsøg 22, 23 og 24 foretaget langtidsoxidation i mørke. Selv om iltforbruget her viste en kraftig oxidation, tydede de øvrige analyser på det modsatte. Ægtesten viste ikke tegn på, at prøverne var kraftigt oxideret, men forsøgene er for usikre til at tillade en klar konklusion.

Oxidationsforsøgene besvares altså enten af en meget langsommelig, men praksis-orienteret, oxidation, eller af, at de oxidationsprodukter, der fremkommer ved accelereret, lysinduceret oxidation, ikke kan antages at ligne praksis.

Æg-testen og fedtharskning

Formålet med projektet var at udvikle æg-testen til en praktisk anvendelig test for toxiske komponenter i foderstoffer.

De uventede problemer, der bl.a. er beskrevet i det foregående, lagde beslag på en ret stor del af tid og midler, og mængden af resultater til belysning af æg-testens praktiske værdi blev derfor reduceret i forhold til forventningerne.

De forsøg, der belyste fedtkvalitet og æg -test, var endvidere lidt forskellige i metode, alt efter tidspunktet de blev foretaget på, hvilket vanskeliggjorde sammenligning.

Generelt kan det dog siges, at mens solsikkeolie ikke var toxisk i ikke-oxideret tilstand, var foderfedt ret toxisk, selv nar der var tale om sunde varer med pæne analysetal. Dette gjorde det vanskeligere at erkende effekten af oxidation på foderfedt, mens oxidation af solsikkeolie havde en klar toxisk effekt, der ydermere

var afhængig af oxidationegraden (forsøg 15). De tydeligste tal for foderfedt findes i forsøg 18, hvor der er tendens til lignende sammenhæng.

Med disse erfaringer blev det besluttet at foretage et slutforsøg i større skala (forsøg 24). Dette inkluderede æg-test, kemiske analyser og fodringsforsøg (kyllinger) med oxideret kyllingefoder. Som beskrevet udeblev resultaterne fra forsøg, fordi den forblanding, der var anvendt til foderet indeholdt et giftstof, som medførte, at næsten alle fostre i æg-testen døde.

Ved æg-test på byggen, der også var anvendt til foderet, konstateredes ingen toxicitet. Andre forblandinger viste heller ikke toxicitet. Denne skulle ellers forventes, da foderfedt i alle tidligere forsøg havde været toxisk.

En mulig forklaring var, at det toxiske princip der åbenbart fandtes i alle foderstoffer, blev udfaldet i hexanfældningen, der kun udførtes i forsøg 24. Herigennem ville der så være et spinkelt, fagligt grundlag for videre arbejde.

Imidlertid bevirker summen af erfaringerne med æg-testen, at den i øjeblikket må anses for at være uegnet til generel anvendelse i foderstofsektoren. For det første er den ikke billig, idet en serieanalyse, med minimal sikkerhed for resultatet, vil koste 500-1.000 kr. For det andet skal den altid følges op af specifikke, kemiske analyser. For det tredje tager udførelsen af testen ca. 10 dage, og for det fjerde er den stadig ikke tilstrækkeligt afprøvet og kan kun blive det under anvendelse af store Økonomiske og tidsmæssige omkostninger.

Når det er sagt, skal det også bemærkes, at æg testen, efter at den er udviklet i nærværende projekt, vil være anvendelig til forskningsopgaver og måske analyser af råvarekvaliteter i specielle tilfælde.

Reference
-	Archer, M., 1974: Detection of mycotoxins in foodstuffs by use of chick embryos. Mycopathologia et Mycologia applicata 54 453-467.
-	Rasmussen, P. Skovmand og Holm, Finn, 1978: Kvaliteten af foder til enmavedyr - i relation til lagring og teknisk forarbejdning. Beretning nr. 86 fra Bioteknisk Institut. 49 sider, ill. Instituttets publikationsstue (offset), Kolding.
-	Freemann, B.M. and Vince, M.A., 7974: Development of the avian embryo. 362 sider, ill. Chapman and Hall Ltd., London.
-	Rasmussen, P. Skovmand og Jacobsen, E.E., 1978: Æg-testen - en ny biologisk analysemetode til vurdering af foderkvalitet. Appendiks til denne beretninq.
-	Dervish, M.T., 1976: The use of egg embryos for mycotoxin examination. Second meeting on mycotoxins in animal disease. 65 sider, ill. Ministry of Agriculture Fisheries and Food, England.
-	Ashoor, S.H. and Chu, F.S., 1975: Reduction of aflatoxins B₁ and B₂ with sodium borohydride. Journal of the AOAC 58: 492-496.
-	Jacobsen, E.E., 1974: Vurdering af foderblandinger. Meddelelser fra Korn- og Foderstofafdelingen, Bioteknisk Institut 7:10-11. Instituttets publikationsstue (offset), Kolding.

Kilde:

Beretning nr. 94, 1980. Bioteknologisk Institut, Holdbergsvej 10, 6000 Kolding. Tlf. 75520433

Æg-test: En biologisk metode til bestemmelse af giftige stoffer i foder